超声波辅助提取灵芝三萜工艺研究

康同辉　张一凡　解婉莹　王涵　席春侠　舒彦宇　袁媛

摘要：采用超声波辅助提取灵芝三萜，基于单因素试验结果，以灵芝三萜得率为评价指标，采用正交试验方法优化灵芝三萜提取工艺条件。结果表明，在乙醇浓度85%、超声时间15 min、超声温度80 ℃、料液比1∶25的条件下，灵芝三萜得率最高、为2.19%。

关键词：灵芝；三萜；超声波；提取；优化；正交试验

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2017）06-0041-03

灵芝又称灵芝草、仙草、瑞草，在药物领域中已有2000多a的使用历史，是我国最著名的高等药用真菌。灵芝具有抗肿瘤、调节免疫、镇静镇痛、抗肝损伤、改善记忆、降脂、抗辐射、降血糖、抗血栓、抗疲劳等药理作用。灵芝不仅具有广泛的药用价值，因其无毒、无害、无副作用，在食品领域也早有应用，是一种极佳的药食两用物质。灵芝中的多糖、三萜、生物碱、核苷等有效成分是灵芝发挥治疗作用的物质基础。但灵芝三萜的含量相对较低，对照品也很难获得，且在提取过程中不稳定。因此，需要寻求一种切实可行的方法来提高灵芝三萜得率。本研究采用超声波法对灵芝三萜提取工艺条件进行优化，以期为灵芝三萜的工业化生产及其产品的深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝：吉林敖东世航产业股份有限公司；齐墩果酸标准品：沈阳市国药试剂有限公司；无水乙醇、冰乙酸、香草醛、高氯酸、乙酸乙酯均为分析纯。

1.2 仪器设备

WFZUV-2000型紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；AXTD5A型台式低速离心机：盐城市安信实验仪器有限公司；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；TB-114型电子天平：梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；KQ5200DB型数控超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 灵芝三萜提取工艺流程 取适量灵芝烘干→粉碎→准确称取适量灵芝粉末→加入乙醇→超声辅助浸提→真空抽滤→滤液浓缩→干燥，即得灵芝三萜。

1.3.2 标准曲线绘制 准确称取5.0 μg齐墩果酸标准品于25 mL容量瓶中，加入无水乙醇，定容，即得母液。精确吸取母液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL分别置于试管中，以试剂为空白参比，沸水浴挥发去除溶剂，挥发完全后加入0.4 mL 5%香草醛—冰乙酸和1.6 mL高氯酸，摇匀后将试管置于70 °C水浴锅中加热处理15 min，取出后用冰水快速冷却至室温，再加入8 mL乙酸乙酯，混匀，在560 nm处测定吸光度值。以齐墩果酸浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得到：y=8.323 5 x-0.047 8，R2=0.999 7，线性关系良好。

1.3.3 灵芝三萜测定 精密称取灵芝三萜粉末1 g，加入乙醇，采用超声波提取，抽滤，准确吸取无水乙醇和三萜滤液各1 mL于试管中，按1.3.2中方法测定560 nm处的吸光度，根据标准曲线计算待测液中的三萜含量Y，利用下式计算三萜得率。

三萜得率（%）={（Y/1 000）/[（m/50） ×V]} ×100

式中：m为样品质量，mg；V为吸取滤液的体积，mL；Y为灵芝三萜含量，μg。

1.3.4 单因素试验 在其他条件相同的情况下，分别考察乙醇浓度（55%，65%，75%，85%，95%），料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶45），超声温度（40，50，60，70，80 °C），超声时间（5，15，25，35，45 min），超声功率（50，140，160，180，200 W）对灵芝三萜得率的影响。

1.3.5 正交试验 在单因素试验结果的基础上，以灵芝三萜得率为指标，进行L9（34）正交试验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对灵芝三萜得率的影响 不同乙醇浓度下灵芝三萜得率如图1所示。

由图1可以看出：灵芝三萜得率随乙醇浓度升高而提高。当乙醇浓度为55%时，灵芝三萜得率仅为0.29%；当乙醇浓度为95%时，灵芝三萜得率最高，为1.69%；而乙醇浓度在85%～95%之间时，灵芝三萜得率非常相近。

2.1.2 料液比对灵芝三萜得率的影响 不同料液比下灵芝三萜得率如图2所示。

由图2可以看出：在料液比为1∶30时，灵芝三萜得率最高，为1.71%；当料液比小于1∶30时，溶剂量过少，样液过于粘稠，不利于超声波空化作用的产生，也不利于超声波在溶剂中的传播扩散，所以提取率相对较低；随着料液比的增大，灵芝三萜得率提高，但是当料液比超过1∶30时，可能因溶剂量过大反而影响了超声波对灵芝细胞的破碎，进而影响了机械学和热力学作用，导致灵芝三萜得率降低。

2.1.3 超声温度对灵芝三萜得率的影响 不同超声温度下灵芝三萜得率如图3所示。

由图3可以看出：当超声温度在40～50 ℃之间时，灵芝三萜得率随温度升高而提高；而温度在50～70 ℃之间时，灵芝三萜得率增幅较小；当温度为70 ℃时，灵芝三萜得率最高，为2.09%。说明随着超声温度的升高，分子运动愈发剧烈，加快了灵芝三萜的扩散和溶剂向灵芝内部的渗透，促进了细胞內三萜的浸出。

2.1.4 超声时间对灵芝三萜得率的影响 不同超声时间下灵芝三萜得率如图4所示。

由图4可以看出：当超声时间为25 min时，灵芝三萜得率最高，为1.95%；当超声时间少于25 min时，灵芝三萜得率随超声时间延长而增大；但当超声时间超过25 min后，灵芝三萜得率反而降低，其原因可能是长时间的超声处理破坏了灵芝三萜的结构。endprint

2.1.5 超声功率对灵芝三萜得率的影响 不同超声功率下灵芝三萜得率如图5所示。

由图5可以看出：当超声处理功率为150 W时，灵芝三萜得率最高，为1.81%；功率过小，超声波振动幅度过小，灵芝细胞壁破碎不完全，三萜溶出不彻底；功率过大，则造成溶液分子运动加剧，反而使得率略降低。说明过高或过低的超声波功率均不利于灵芝三萜的提取。

2.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，以乙醇浓度（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、料液比（D）为自变量，以灵芝三萜得率为评价指标，进行正交试验，结果见表1。

由表1可知，各因素对灵芝三萜提取得率影响的主次顺序为C>A>B>D，即超声温度>乙醇浓度>超声时间>料液比，其中超声温度的影响最大，料液比的影响最小。由正交试验得到最佳工藝组合为A3B1C3D1。

2.3 最佳工艺条件验证

根据正交试验结果，对工艺组合A3B1C3D1和A3B1C3D2进行验证。结果为工艺组合A3B1C3D1的得率（2.19%）高于A3B1C3D2的得率（2.13%），表明正交试验方法优化得到的灵芝三萜提取工艺条件可靠，最佳工艺条件为乙醇浓度85%、超声时间15min、超声温度80 ℃、料液比1∶25。

3 结论

本研究以灵芝为原料，通过单因素试验和正交试验设计，确定超声波辅助乙醇浸提灵芝三萜的最佳工艺条件。试验结果表明，各因素对三萜提取影响程度大小顺序为超声温度>乙醇浓度>超声时间>料液比，最佳工艺条件为乙醇浓度85%、超声时间15min、超声温度80 ℃、料液比1∶25，此时灵芝三萜得率为2.19%。该方法具有工艺简单、提取率高、便于工业化生产等优点，可为灵芝三萜产品的深度开发提供理论依据。

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