厄他培南耐药肠杆菌科细菌碳青酶烯基因分析与耐药传递机制研究

苏小燕，罗云俐，叶 涛，何云燕

(重庆市人民医院检验科 400013)

厄他培南耐药肠杆菌科细菌碳青酶烯基因分析与耐药传递机制研究

苏小燕，罗云俐，叶 涛，何云燕△

(重庆市人民医院检验科 400013)

目的研究重庆某三级医院对厄他培南不敏感肠杆菌科细菌所携带的碳青酶烯耐药基因类型及耐药传递方式。方法对临床分离出的厄他培南不敏感肠杆菌科细菌采用改良Hodge试验检测碳青霉烯酶产生情况；PCR扩增常见耐药基因并测序确定碳青酶烯酶基因；质粒结合试验研究耐药基因的传播方式。结果在临床772株肠杆菌科细菌中分离出14株对厄他培南不敏感菌株(耐药12株，中介2株)。13株改良Hodge试验阳性，其中12株携带blaOXA基因，9株携带blaIMP基因，2株携带blaKPC基因；首次发现同时携带blaOXA-1、blaIMP-8和blaKPC-2 3种耐药基因的阴沟肠杆菌，改良Hodge试验阴性的1株阴沟肠杆菌没有检测出耐药基因，且该菌株质粒结合试验失败。结论该院分离的厄他培南不敏感的肠杆菌科细菌所携带耐药基因以blaIMP-8和blaOXA-1为主，且主要通过质粒传播。

细菌，抗药性；肠杆菌科细菌；厄他培南；质粒

肠杆菌科细菌是引起医院感染最常见病原体。由于产超广谱β内酰胺酶和AmpC酶菌株的高分离率，碳青酶烯类药物成为治疗耐药肠杆菌感染的首选[1-3]。但随着碳青酶烯类药物的广泛应用，肠杆菌科细菌对其耐药已明显升高，给临床抗感染治疗带来挑战[4]。产碳青霉烯酶是该类细菌耐药的最主要的因素之一。厄他培南是美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的筛选药物，本研究对2013年10月至2015年3月本院临床分离的厄他培南不敏感的肠肝科细菌所携带的碳青霉烯酶基因种类和耐药基因传递方式进行研究，为本院碳青酶烯类耐药的肠杆菌科细菌感染的预防和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 2013年10月至2015年3月本院所有临床标本中分离出对厄他培南耐药或中介[最小抑菌浓度(MIC)>4]的肠肝科细菌14株，包括8株阴沟肠杆菌和6株大肠埃希菌。分别来自骨科(4株)、ICU病房(3株)、呼吸科(2株)、泌尿科(2株)、普外科(2株)、心胸外科(1株)，标本种类为伤口分泌物(5株)、痰液(3株)、尿液(3株)、血液(1株)、胆汁(1株)和引流液(1株)。所收集菌株均排除同一患者来源的相同菌株。

1.2试剂与仪器 Vitek2 Compact全自动细菌鉴定和药敏系统(法国生物梅里埃公司)；MH琼脂(杭州天和公司)；Taq DNA聚合酶、DNA Marker、6×loading buffer上样缓冲液(大连宝生物公司)；引物合成(上海英俊公司)；PCR扩增仪、紫外凝胶成像仪(成都百乐科技公司)。

1.3方法

1.3.1细菌鉴定与药敏试验 根据CLSI制订的微生物临床检验标准及操作规程进行标本采集、接种和培养，用Vitek2 Compact系统对菌株进行鉴定和药敏检测，结果解释参照2014版CLSI M100-S24标准[5]。

1.3.2改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株 按药敏试验操作规程，将调成0.5麦氏当量的大肠埃希菌ATCC 25922细菌稀释液稀释10倍后，均匀涂布于MH平板上，室温待干。将厄他培南药敏纸片(每片10 μg)贴于MH平板中间。用无菌接种环取适量待测菌、阳性对照菌及阴性对照菌，自纸片外缘向平板边缘划直线，35 ℃过夜孵育后观察结果。在中央抑菌圈内出现明显矢状生长者为产碳青霉烯酶菌株。

1.3.3耐药菌DNA模板的制备 取过夜震荡培养的菌液1.5 mL，6 000 r/min 4 ℃离心5 min，弃上清液；加750 μL去离子水重悬沉淀，6 000 r/min 4 ℃离心5 min，弃上清液；加300 μL去离子水重悬沉淀，95 ℃ 水浴10 min，冰上速冷2 min；12 000 r/min 4 ℃离心2 min，取上清液200 μL即为所需DNA模板，-20 ℃保存备用。

1.3.4耐药基因的检测 PCR总反应体积为25 μL，包括Primer Buffer 12.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，待测菌的DNA模板1 μL，去离子水10.5 μL。引物序列及参考文献见表1，扩增条件和结果观测如来源文献所述。阳性扩增产物测序后，用NCBI网站中的BLAST程序进行比对，确认具体基因型。

1.3.5质粒结合试验 以分离的14株临床菌株为供体菌，EC600为受体菌，分别取供体菌和受体菌过夜培养菌液200 μL和100 μL混合于600 μL的LB肉汤中，37 ℃静置孵育18 h。接合子接种于含利福平700 μg/mL和厄他培南0.5 μg/mL的选择培养基上，24～48 h后观察，有菌落生长者即为结合成功，并同时以供体菌和受体菌在同一培养基内做阴性对照。

2 结 果

2.1药敏试验结果 临床分离的14株细菌，对厄他培南中介2株，包含大肠埃希菌和阴沟肠杆菌各1株，其余12株菌均对厄他培南耐药。

2.2改良Hodge试验结果 本研究分离的14株耐药菌中，13株改良Hodge试验阳性，1株阴沟肠杆菌为阴性。

2.3耐药基因检测结果 14株耐药菌中，13株细菌携带常见耐药基因。其中12株携带blaOXA-1基因，8株携带blaIMP-8基因，2株携带blaKPC-2基因，1株携带blaIMP-26基因。1株阴沟肠杆菌不携带所扩增的常见耐药基因。见表2。

2.4质粒结合和消除试验 除骨科病房分离的1株阴沟肠杆菌外，其余13株细菌质粒结合试验均成功。

表1 耐药基因引物序列

表2 14株肠杆菌科细菌来源及其耐药基因扩增结果

3 讨 论

碳青霉烯类抗菌药物在临床上被认为是治疗多重耐药菌感染的最佳选择，但伴随此类药物的大量应用，世界各地陆续发现耐碳青霉烯类的肠杆菌科细菌[2]。本研究共检测临床菌株772株，对厄他培南不敏感14株，分离率是1.81%，低于同期我国耐药监测网显示全国1.9%的耐药率，高于重庆1.5%的耐药率。

产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药的主要原因。碳青霉烯酶包括Ambler分类中的A、B、D 3类[7]。A类是丝氨酸蛋白酶，主要包含blaSME和blaKPC。B类为金属酶，主要包含blaIMP和blaVIM。D类又称为OXA酶。本研究对14株耐药菌进行常见耐药基因扩增和测序，发现blaOXA-1和blaIMP-8是存在于本院耐药菌中的主要耐药基因,这与杨勇文等[8]报道的肠杆菌科细菌中主要流行的是blaOXA-48不同。blaKPC基因最常见于克雷伯菌属，河南郑州地区报道过携带blaKPC-2的肺炎克雷伯菌和日沟维肠杆菌[9],携带blaKPC-2的阴沟肠杆菌目前少见报道。同时携带blaOXA-1，blaIMP-8和blaKPC-2 3种耐药基因的阴沟肠杆菌国内亦未见报道。14株耐药菌有13株质粒结合试验成功，表明本院耐药基因可以通过质粒传播。

本研究中，来自普外科的两株阴沟肠杆菌携带相同耐药基因，经进一步核实，两株菌的分离时间相差两周，其携带者存在同时住院的情况，所以不能排除医院感染的可能性。骨科分泌物中分离的两株大肠埃希菌同时携带blaOXA-1，但其分离时间间隔8个月，第1株耐药菌携带者出院5个月后，第2株耐药菌携带者才入院，可以排除医院感染。

本研究还发现1株改良Hodge阴性的阴沟肠杆菌，耐药基因扩增结果亦为阴性，初步推断，可能是由于产ESBLs或Amp C酶等其他因素造成。该菌株质粒结合试验失败，考虑耐药基因可能是垂直传播或通过整合子的方式水平传播，有待进一步确定。

[1]Queenan AM,Torres-Viera C,Gold HS,et al.SME-type carbapenem-hydrolyzing class A beta-lactamases from geographically diverse Serratia marcescens strains[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(11):3035-3039.

[2]Jones CH,Tuckman M,Keeney D,et al.Characterization and sequence analysis of extended-spectrum-{beta}-lactamase-encoding genes from Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,and Proteus mirabilis isolates collected during tigecycline phase 3 clinical trials[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(2):465-475.

[3]Qi C,Malczynski M,Parker M,et al.Characterization of genetic diversity of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clinical strains collected from 2004 to 2007[J].J Clin Microbiol,2008,46(3):1106-1109.

[4]Harris P,Paterson D,Rogers B.Facing the challenge of multidrug-resistant gram-negative bacilli in Australia[J].Med J Aust,2015,202(5):243-247.

[5]Clinlcal and Laboratory Standards Institute.Performance standaras for antimicrobial susceptibility testing;twenty-fourth informational supplement M100-S24[S].Wayne,PA:CLSI,2014.

[6]Tsakris A,Pournaras S,Woodford N,et al.Outbreak of Infections Caused by Pseudomonas aeruginosa Producing VIM-1 Carbapenemase in Greece[J].Clin Microbiol,2000,38(3):1290-1292.

[7]Queenan AM,Bush K.Carbapenemases:the versatile beta-lactamases[J].Clin Microbiol Rev,2007,20(3):440-458.

[8]杨勇文，李从荣．耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因研究进展[J]．山东医药，2016，56(2)：96-98．

[9]许俊红，王中全．质粒介导的KPC-2型碳青霉烯酶水平传播机制的探讨[J]．医药论坛杂志，2013，34(1)：87-88．

苏小燕(1985-)，硕士，主要从事细菌耐药性及感染预防方面的研究。△

，E-mail:1210427994@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.032

R378.2

B

1671-8348(2017)28-3981-03

2017-04-15

2017-06-16)