Let-7b对骨髓基质干细胞诱导分化为神经元的作用研究

李进领，李 智，李 琳，张 静，贾延劼，安 颖

1.450007河南省郑州市，郑州大学附属郑州中心医院神经内科 2.119991俄罗斯莫斯科，莫斯科国立谢东诺夫第一医科大学 3.450052河南省郑州市，郑州大学第一附属医院神经内科

·论著·

*通信作者：张静，主治医师；E-mail：yzkl0112@163.com

Let-7b对骨髓基质干细胞诱导分化为神经元的作用研究

李进领1，李 智2，李 琳1，张 静3*，贾延劼3，安 颖1

1.450007河南省郑州市，郑州大学附属郑州中心医院神经内科 2.119991俄罗斯莫斯科，莫斯科国立谢东诺夫第一医科大学 3.450052河南省郑州市，郑州大学第一附属医院神经内科

目的探讨Let-7b在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元过程中的作用。方法2013年1—12月将80只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、阴性对照组、Let-7b-up慢病毒载体(LV-rno-Let-7b-up)组、Let-7b-inhibition慢病毒载体(LV-rno-Let-7b-inhibition)组，每组20只。将阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组大鼠分别感染EGFP空病毒，采用颈椎脱臼法处死4组大鼠，并获取MSCs，传代培养4代后备用。取传代培养的MSCs感染慢病毒，具体为：空白对照组、阴性对照组不进行感染，LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组分别感染LV-rno-Let-7b-up、Let-7b-inhibition，采用MTT法检测感染前、感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率。采用法舒地尔对4组进行诱导实验，观察MSCs分化为神经元的分化效率。采用免疫组化法检测4组神经元烯醇化酶(NSE)、神经微管结合蛋白(MAP-2)、微管相关蛋白(Tau)水平，RT-PCR法检测4组NSE、MAP-2、Tau mRNA水平。结果LV-rno-Let-7b-up组MSCs于LV-rno-Let-7b-up感染后第3天荧光表达最强，LV-rno-Let-7b-inhibition组MSCs于LV-rno-Let-7b-inhibition感染后第5天荧光表达最强。感染第5天时，阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组MSCs感染率分别为87.46%、86.81%、87.12%。感染后24 h、5 d阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组MSCs存活率低于空白对照组(P<0.05)；阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组感染后5 d MSCs存活率高于感染后24 h(P<0.05)。阴性对照组和空白对照组部分MSCs呈现神经元样改变；LV-rno-Let-7b-up组极大部分MSCs出现典型的神经元样结构；LV-rno-Let-7b-inhibition组仅有少量MSCs出现典型的神经元样结构。LV-rno-Let-7b-up组NSE、MAP-2、Tau及其mRNA水平高于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-inhibition组NSE、MAP-2、Tau及其mRNA水平低于空白对照组、阴性对照组(P<0.05)。结论感染LV-rno-Let-7b-up后大鼠MSCs分化为神经元的分化效率增加，提示Let-7b可促进MSCs向神经元分化。

神经元；干细胞,骨髓；慢病毒属；Let-7b；细胞分化

骨髓基质干细胞(MSCs)是骨髓中除造血干细胞外的具有高度可塑性的细胞群体，其在特定条件下可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经元、骨骼肌细胞和心肌细胞[1-4]。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物内发现的一种能起到调控作用的核苷酸单环非编码RNA，其可以调控多种病理生理过程，包括细胞的增殖、分化、凋亡、神经元突触形成、肿瘤发生等。miRNAs参与了所有动物的发生、发展和病理过程，其生物合成受严格的时间和空间控制。Let-7家族是较早发现的一类人类miRNAs，其可调控干细胞的生物学行为，与人类多种疾病的发生存在密切关系[5-10]，分为10个亚型,Let-7b为其中之一。由于Let-7b在大鼠MSCs分化为神经元过程中的作用机制尚不清楚，故本研究采用慢病毒载体感染MSCs，诱导、分化神经元，检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经微管结合蛋白(MAP)-2、微管相关蛋白(Tau)水平表达变化，探讨Let-7b在MSCs分化为神经元过程中的作用，为MSCs的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞 雌雄不限的SPF级SD大鼠80只，6～8周龄，体质量100～120 g，购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。EGFP空病毒购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.1.2 实验分组 将80只大鼠随机分为空白对照组、阴性对照组、Let-7b-up慢病毒载体(LV-rno-Let-7b-up)组、Let-7b-inhibition慢病毒载体(LV-rno-Let-7b-inhibition)组，每组20只。

1.1.3 研究时间 2013年1—12月。

1.2 研究方法

1.2.1 获取MSCs 4组大鼠常规饲养2周后，将阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组分别感染EGFP空病毒，采用颈椎脱臼法处死所有大鼠，于75%乙醇中浸泡5 min后从大鼠股骨和胫骨中获取MSCs，48 h后半量换液，4 d后全换液，此后根据细胞生长情况每2～3 d换液1次继续培养，当细胞融合度达80%～90%时再进行传代。MSCs根据以上方法连续传代培养4代后浸入液氮中备用。

1.2.2 LV-rno-Let-7b-up、LV-rno-Let-7b-inhibition感染 从液氮中取出4组传代培养4代以上的大鼠MSCs，感染前18～24 h将贴壁细胞以1×105个/孔的密度接种至24孔板，培养2～3 d，直至细胞融合度达50%左右，按3个不同的最适感染复数(MOI)值(MOI=3、10、20)添加病毒液(LV-rno-Let-7b-up、Let-7b-inhibition)和终浓度为5 μg/ml的聚凝胺；即空白对照组、阴性对照组不进行感染，LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组分别感染LV-rno-Let-7b-up、Let-7b-inhibition，培养24 h后换液。再培养48 h后，在倒置荧光显微镜下观察各组感染情况，并采用MTT法检测感染前、感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率。

1.2.3 体外诱导MSCs分化为神经元 采用法舒地尔对各组细胞进行诱导实验。取各组感染后的细胞进行诱导，待成活细胞荧光表达最强和细胞融合度达50%左右时，去除DMEM完全培养基，采用PBS冲洗3次(贴培养板孔壁缓慢加入，防止细胞脱壁)后，加入预诱导剂(DMEM+10%胎牛血清+200 μmol/L法舒地尔)置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养2 h，并于倒置荧光显微镜下观察分化效率。

1.2.4 免疫组化法检测NSE、MAP-2、Tau水平 将各组感染后并诱导分化2 h的细胞采用PBS冲洗3次，加入4%多聚甲醛1 ml固定，置于4 ℃冰箱过夜。次日吸出多聚甲醛，0.1% TBST缓冲液500 μl冲洗3次，3～5 min/次(或TBST缓冲液浸润10 min)，用移液管吸出弃去。加入5%胎牛血清500 μl，封闭1 h，吸出封闭液，加稀释后的一抗(1∶200)NSE抗体(1.0 mg/L)、MAP-2抗体(1.0 mg/L)、Tau抗体(1.0 mg/L)各500 μl，置于4 ℃冰箱过夜。弃除一抗，用0.1% TBST缓冲液500 μl冲洗3次，3～5 min/次。加稀释后的二抗Cy3标记的山羊抗兔IgG(1∶200)500 μl，室温下放置1 h。用移液管吸出二抗并弃去，0.1%TBST缓冲液500 μl冲洗3次。采用荧光显微镜进行观察，应用Image Pro Plus 6.0进行图像分析NSE、MAP-2、Tau水平。

1.2.5 采用RT-PCR法检测NSE、MAP-2、Tau mRNA水平 参照Gotaq qPCR Master Mix (Promega)操作说明和1.5 Light Cycler RT-PCR系统(Roche)对cDNA进行PCR扩增。MAP-2上游引物为5′-CCACCCAGAAAACCTCATGA-3′，下游引物为5′-CATCCCGGTAAGTCCAATCA-3′；NSE上游引物为5′-TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT-3′，下游引物为5′-AACCACACAACCTACTACCTCA-3′；Tau上游引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件：94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，共30个循环，然后72 ℃延伸5 min，4 ℃静置。采用相对定量法(2-ΔΔCt法)计算NSE、MAP-2、Tau mRNA水平。

2 结果

2.1 MSCs培养情况 体外传代培养第2代MSCs呈扁圆形，体外培养第5代MSCs呈长梭形(见图1，本文图1～3彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章)。

2.2 LV-rno-Let-7b-up、LV-rno-Let-7b-inhibition感染情况 LV-rno-Let-7b-up组MSCs于LV-rno-Let-7b-up感染后第3天荧光表达最强，LV-rno-Let-7b-inhibition组MSCs于LV-rno-Let-7b-inhibition感染后第5天荧光表达最强。感染第5天时，阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组MSCs感染率分别为87.46%、86.81%、87.12%(见图2)。

注：A为体外传代培养第2代，B为体外传代培养第5代

图1 普通光学显微镜下MSCs形态(×200)

Figure1 MSCs morphology under the normal optical microscope

注：A为阴性对照组，B为Let-7b-up慢病毒载体(LV-rno-Let-7b-up)组，C为Let-7b-inhibition慢病毒载体(LV-rno-Let-7b-inhibition)组

图2 荧光显微镜下感染第5天时MSCs形态(×200)

Figure2 Morphology of MSCs on the fifth day after infection under fluorescence microscopy

2.3 4组感染前后不同时间点MSCs存活率比较 4组感染前MSCs存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；4组感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；感染后24 h、5 d阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组MSCs存活率低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组感染后5 d MSCs存活率高于感染后24 h，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.4 MSCs分化为神经元的分化效果 阴性对照组和空白对照组部分MSCs呈现神经元样改变，发起多个分支，突起变长，胞体收缩，连接成网状，且两组分化效果相似；LV-rno-Let-7b-up组极大部分MSCs出现突起，胞体收缩，交织成网，形成典型的神经元样结构；LV-rno-Let-7b-inhibition组仅有少量MSCs出现典型的神经元样结构(见图3)。

2.5 4组NSE、MAP-2、Tau水平比较 4组NSE、MAP-2、Tau水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-up组NSE、MAP-2、Tau水平高于空白对照组、阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-inhibition组NSE、MAP-2、Tau水平低于空白对照组、阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图4)。

2.6 4组NSE、MAP-2、Tau mRNA水平比较 4组NSE、MAP-2、Tau mRNA水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-up组NSE、MAP-2、Tau mRNA水平高于空白对照组、阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；LV-rno-Let-7b-inhibition组NSE、MAP-2、Tau mRNA水平低于空白对照组、阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

3 讨论

MSCs在临床研究中拥有广泛的应用前景[11]。因MSCs为具备较强增殖、多向分化潜能的干细胞，在特定条件下能够向内胚层、中胚层及外胚层分化，其作为供体细胞越来越多地应用于细胞治疗及组织工程。作为供体细胞的MSCs具有几个优势：(1)相对易获取；(2)体外培养时能快速增殖；(3)具有免疫耐受性或免疫无反应性；(4)可长时间存活并能与宿主体内的结构相整合；(5)能被稳定转染，作为基因载体能长期表达外源性基因；(6)能够自体移植，解决了免疫排斥的问题。临床上已有将MSCs应用于阿尔茨海默病、多发性硬化的临床治疗[12-13]。1993年，LEE等[14]在秀丽新杆状线虫中首次发现了miRNAs，随后miRNAs在MSCs生物学行为中的重要调控作用逐步显现。miRNAs可经转录、表观遗传学调控基因组及异染色质形成等方式调控基因组的表达，参与MSCs重要生物学进程，包括增殖、分化、信号转导、死亡等[15-17]。人类细胞中的Let-7可起到促进分化的重要作用[18-19]。Let-7参与多个信号通路[11,20-23]，其可通过不止一个环节抑制Insulin-磷脂酰肌醇 (PI3K)-mTOR通路，而后者参与了干细胞的增殖、神经分化和自噬。

表1 4组感染前、感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与感染后24 h比较，bP<0.05；LV-rno-Let-7b-up=Let-7b-up慢病毒载体，LV-rno-Let-7b-inhibition=Let-7b-inhibition慢病毒载体

表2 4组NSE、MAP-2、Tau水平比较

注：NSE=神经元烯醇化酶，MAP=神经微管结合蛋白，Tau=微管相关蛋白；与空白对照组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

注：A为空白对照组，B为阴性对照组，C为LV-rno-Let-7b-up组，D为LV-rno-Let-7b-inhibition组

图3 荧光显微镜下诱导分化2 h后MSCs形态(×200)

Figure3 MSCs morphology at 2 h after inducement and differentiation under fluorescence microscopy

注：A为空白对照组，B为阴性对照组，C为LV-rno-Let-7b-up组，D为LV-rno-Let-7b-inhibition组

图4 荧光显微镜下4组MAP-2表达情况(免疫组化染色，×200)

Figure4 Expression level of MAP-2 in the 4 groups under fluorescence microscopy

表3 4组NSE、MAP-2、Tau mRNA水平比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05

NSE是一种糖酵解酶，特异性地存在于神经元及神经内分泌细胞中。近年来，NSE成为神经元损伤的敏感性、特异性标志物[24]。MAP是细胞骨架中微管主干蛋白之外的一些蛋白成分，其中Tau主要见于中枢神经系统的神经元中，且少见于其他细胞，可作为神经轴突的标志分子[25]。MAP-2是构成神经元骨架的重要蛋白,参与形成细胞内的丝网状结构,维持细胞形态,是原始神经上皮中所表达的最早的神经元标志物之一，并广泛应用于神经生物学研究[26]。

Let-7b作为Let-7家族成员之一，其在MSCs分化为神经元过程中的作用目前尚不清楚。本研究采用Let-7b过表达和抑制慢病毒载体感染MSCs，观察Let-7b在MSCs诱导分化中的作用。YU等[27]发现，Let-7家族在胚胎干细胞分化为神经前体细胞后，其水平急剧增加，并占主导地位，说明Let-7参与调控神经干细胞分化。本研究结果显示，空白对照组、阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组感染前MSCs存活率无差异，感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率有差异,表明Let-7b可以高效感染大鼠MSCs，感染后EGFP可稳定表达。MTT法检测结果显示，感染Let-7b后MSCs存活率下降，免疫组化结果显示，MSCs感染Let-7b后神经元分化效率明显提高，神经元的早、中期标志物NSE和成熟神经元特异性标志物MAP-2水平均显著增高。考虑Let-7b可能在MSCs横向分化为神经元过程中起作用，提高Let-7b水平，可促进MSCs向神经元分化。本研究结果显示，单独感染Let-7b并不能使MSCs分化为神经元，必须在法舒地尔作为诱导剂的条件下MSCs才能分化神经元，表明Let-7b在MSCs横向分化为神经元过程中的作用不是唯一的，可能是对某一些信号途径控制，如TLR信号通路、Wnt信号通路、Hmga2信号通路等，从而提高诱导效率。

由于本研究未进行MSCs体内移植实验，MSCs在体内存活率及分化为神经元的效率也未得到研究，异体移植所引起的免疫排斥反应如何也未研究。本课题组拟在后续实验中继续观察感染的MSCs体内存活率、细胞分化效率及免疫排斥反应，进一步探讨Let-7b慢病毒载体感染MSCs后移植入大鼠体内所产生各种反应的分子机制。

综上所述，感染LV-rno-Let-7b-up能加快MSCs分化为神经元的分化效率，同时其NSE、MAP-2、Tau水平亦升高，本结果可为干细胞的临床试验提供一定的理论依据。

作者贡献：李进领资进行料收集整理，撰写论文；李智、安颖对论文进行校对，并负责英文润色；李琳进行实验实施、评估、资料收集；张静进行实验设计与实施、资料收集整理，撰写论文；贾延劼进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

[1]YU J M,WU X,GIMBLE J M,et al.Age-related changes in mesenchymal stem cells derived from rhesus macaque bone marrow[J].Aging Cell,2011,10(1):66-79.DOI:10.1111/j.1474-9726.2010.00646.x.

[2]KILPINEN L,TIGISTU-SAHLE F,OJA S,et al.Aging bone marrow mesenchymal stromal cells have altered membrane glycerophospholipid composition and functionality[J].J Lipid Res,2013,54(3):622-635.DOI:10.1194/jlr.M030650.

[3]WEI H,SHEN G,DENG X,et al.The role of IL-6 in bone marrow (BM)-derived mesenchymal stem cells (MSCs) proliferation and chondrogenesis[J].Cell Tissue Bank,2013,14(4):699-706.DOI:10.1007/s10561-012-9354-9.

[4]LI M,IKEHARA S.Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells for organ repair[J].Stem Cells Int,2013,2013:132642.DOI:10.1155/2013/132642.

[5]LEHMANN S M,KRUGER C,PARK B,et al.An unconventional role for miRNA:let-7 activates Toll-like receptor 7 and causes neurodegeneration[J].Nat Neurosci,2012,15(6):827-835.DOI:10.1038/nn.3113.

[6]LONG G,WANG F,LI H,et al.Circulating miR-30a,miR-126 and Let-7b as biomarker for ischemic stroke in humans[J].BMC Neurol,2013,13:178.DOI:10.1186/1471-2377-13-178.

[7]BAO M H,FENG X,ZHANG Y W,et al.Let-7 in cardiovascular diseases,heart development and cardiovascular differentiation from stem cells[J].Int J Mol Sci,2013,14(11):23086-23102.DOI:10.3390/ijms141123086.

[8]HOU W,TIAN Q,STEUERWALD N M,et al.The let-7 microRNA enhances heme oxygenase-1 by suppressing Bach1 and attenuates oxidant injury in human hepatocytes[J].Biochim Biophys Acta,2012,1819(11/12):1113-1122.DOI:10.1016/j.bbagrm.2012.06.001.

[9]GAO Y,MENG H,LIU S,et al.LncRNA-HOST2 regulates cell biological behaviors in epithelial ovarian cancer through a mechanism involving microRNA Let-7b[J].Hum Mol Genet,2015,24(3):841-852.DOI:10.1093/hmg/ddu502.

[10]THORNTON J E,GREGORY R I.How does Lin28 let-7 control development and disease?[J].Trends Cell Biol,2012,22(9):474-482.DOI:10.1016/j.tcb.2012.06.001.

[11]SUPOKAWEJ A,NIMSANOR N,SANVORANART T,et al.Mesenchymal stem cell in vitro labeling by hybrid fluorescent magnetic polymeric particles for application in cell tracking[J].Med Mol Morphol,2015,48(4)：204-213.DOI:10.1007/s00795-015-0102-7.

[12]PERICO N,CASIRAGHI F,INTRONA M,et al.Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation:a pilot study of safety and clinical feasibility[J].Clin J Am Soc Nephrol,2011,6(2):412-422.DOI:10.2215/CJN.04950610.

[13]ZHAO J J,LIN J,LWIN T,et al.microRNA expression profile and identification of miR-29 as a prognostic marker and pathogenetic factor by targeting CDK6 in mantle cell lymphoma [J].Blood,2010,115(13):2630-2639.DOI:10.1182/blood-2009-09-243147.

[14]LEE R C,FEINBAUM R L,AMBROS V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[15]INUI M,MARTELLO G,PICCOLO S.MicroRNA control of signal transduction[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(4):252-263.DOI:10.1038/nrm2868.

[16]GUO L,ZHAO R C,WU Y.The role of microRNAs in self-renewal and differentiation of mesenchymal stem cells[J].Exp Hematol,2011,39(6):608-616.DOI:10.1016/j.exphem.2011.01.011.

[17]LAINE S K,HENTUNEN T,LAITALA-LEINONEN T.Do microRNAs regulate bone marrow stem cell niche physiology?[J].Gene,2012,497(1):1-9.DOI:10.1016/j.gene.2012.01.

045.

[18]BUSSING I,SLACK F J,GROSSHANS H.let-7 microRNAs in development,stem cells and cancer[J].Trends Mol Med,2008,14(9):400-409.DOI:10.1016/j.molmed.2008.07.001.

[19]WRIGHT J E,CIOSK R.RNA-based regulation of pluripotency[J].Trends Genet,2013,29(2):99-107.DOI:10.1016/j.tig.2012.10.007.

[20]JING L,JIA Y,LU J,et al.MicroRNA-9 promotes differentiation of mouse bone mesenchymal stem cells into neurons by Notch signaling[J].Neuroreport,2011,22(5):206-211.DOI:10.1097/WNR.0b013e328344a666.

[21]SOLOMON A,MIAN Y,ORTEGA-CAVA C,et al.Upregulation of the let-7 microRNA with precocious development in lin-12/Notch hypermorphic caenorhabditis elegans mutants[J].Dev Biol,2008,316(2):191-199.DOI:10.1016/j.ydbio.2007.12.046.

[22]WHELAN J T,HOLLIS S E,CHA D S,et al.Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/ MAPK signaling pathway[J].J Cell Physiol,2012,227(3):1235-1241.DOI:10.1002/jcp.22899.

[23]TOLEDANO H,D′ALTERIO C,CZECH B,et al.The let-7-Imp axis regulates ageing of the Drosophila testis stem-cell niche[J].Nature,2012,485(7400):605-610.DOI:10.1038/nature11061.

[24]KULPA J,WOJCIK E,REINFUSS M，et al.Caricinoembryonic antigen，squamous cell carcinoma antigen,CYFRA21-1，and neron-specificenolase in squamous cell lung cancer patients[J].Clin Cheem，2002,48(11):1931-1937.

[25]WANG J Z,LIU F.Microtubule-associated protein tau in development,degeneration and protection of neurons[J].Prog Neurobiol,2008,85(2):148-175.DOI:10.1016/j.pneurobio.2008.03.002.

[26]SUI G P,WU C,SEVERS N,et al.The association between T-type Ca2+current and out ward current in isolated human detrusor cells from stable and overactive bladders[J].BJU Int,2007,99(2):436-441.

[27]YU F，YAO H，ZHU P，et al.Let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells[J].Cell，2007，131(6)：1109-1123.

EffectofLet-7bontheDifferentiationofBoneMarrowMesenchymalStemCellsintoNerveCells

LIJin-ling1,LIZhi2，LILin1,ZHANGJing3*,JIAYan-jie3，ANYing1

1.DepartmentofNeurology，ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007，China2.I.M.SechenovFirstMoscowStateMedicalUniversity,Moscow119991,Russia3.DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052，China

*Correspondingauthor:ZHANGJing，Attendingphysician；E-mail：yzkl0112@163.com

ObjectiveTo investigate the role of Let-7b in the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons.MethodsThis study was conducted in 2013.Eighty SPF grade SD rats were randomly divided into blank control group,negative control group,Let-7b-up lentiviral vector (LV-rno-Let-7b-up) group,Let-7b-inhibition lentiviral vector (LV-rno-Let-7b-inhibition) group,20 rats in each group.The negative control group,LV-rno-Let-7b-up group,LV-rno-Let-7b-inhibition group were injected EGFP blank virus respectively.Four groups of rats were sacrificed by cervical dislocation,and MSCs were obtained and cultured for 4 generations.Subculture of MSCs were infected with lentivirus,that is,the blank control group and the negative control group were not infected,LV-rno-Let-7b-up group,LV-rno-Let-7b-inhibition group were infected with LV-rno-Let-7b-up,Let-7b-inhibition,respectively.The survival rate of MSCs was detected by MTT before infection,at 24 h after infection,on the fifth day after infection.Four groups were induced by fasudil,and the differentiation efficiency of MSCs into neurons was observed.The levels of NSE,MAP-2 and Tau were detected by immunohistochemistry.The levels of NSE mRNA,MAP-2 mRNA and Tau mRNA were detected by RT-PCR.ResultsThe MSCs of LV-rno-Let-7b-up group had the strongest fluorescence expression on the third day after LV-rno-Let-7b-up infection.The MSCs of LV-rno-Let-7b-inhibition group had the strongest fluorescent expression on the fifth day after LV-rno-7b-inhibition infection.On the fifth day after infection,the MSCs infection rates of the negative control group,LV-rno-Let-7b-up group and LV-rno-Let-7b-inhibition group were 87.46%,86.81% and 87.12%,respectively.At 24 h after infection，and on the fifth day after infection the blank control group presented higher survival rate of MSCs than the other three groups (P<0.05).The survival rate of MSCs on the fifth day after infection was found to be higher than that at 24 h after infection in the negative control group,LV-rno-Let-7b-up group and LV-rno-Let-7b-inhibition group (P<0.05).Some MSCs showed neuronal changes in the negative control group and the blank control group,almost all the MSCs showed typical neuron-like structures in LV-rno-Let-7b-up group,but only a small number of MSCs showed a typical neuron-like structure in the LV-rno-Let-7b-inhibition group.The protein and mRNA levels of NSE,MAP-2,Tau in LV-rno-Let-7b-up group were higher than those in blank control group and negative control group(P <0.05);the protein and mRNA levels of NSE,MAP-2,Tau in LV-rno-Let-7b-inhibition group were lower than those in blank control group and negative control group (P<0.05).ConclusionWe found that the differentiation efficiency of MSCs into neurons was increased after infection with LV-rno-Let-7b-up，which suggests that Let-7b promotes the differentiation of MSCs into neurons.

Neurons；Stem cells,myeloid；Lentivirus；Let-7b；Cell differentiation

国家自然科学基金资助项目(81071114，81371385)

R 322.8 R 329.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.122

李进领，李智，李琳，等.Let-7b对骨髓基质干细胞诱导分化为神经元的作用研究[J].中国全科医学，2017，20(33)：4156-4161.[www.chinagp.net]

LI J L,LI Z，LI L,et al.Effect of Let-7b on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells[J].Chinese General Practice，2017，20(33)：4156-4161.

2017-03-03；

2017-07-21)

(本文编辑：毛亚敏)