兴奋剂19-去甲雄酮和19-去甲本胆烷醇酮的检测研究

王静竹 杨瑞，2 刘欣

1 国家体育总局反兴奋剂中心（北京100029）

2 北京体育大学（北京100084）

兴奋剂19-去甲雄酮和19-去甲本胆烷醇酮的检测研究

王静竹1杨瑞1，2刘欣1

1 国家体育总局反兴奋剂中心（北京100029）

2 北京体育大学（北京100084）

目的：19-去甲雄酮（19-Norandrosterone，19NA）和19-去甲本胆烷醇酮（19-Noretiocholanolone，19NE）是竞技体育中禁用的内源性类固醇兴奋剂，可由诺龙代谢而来。本研究的目的是采用同位素比质谱方法对尿中19NA和19NE进行检测规律研究。方法：征集2名男性志愿者。口服20 mg诺龙，并于服药前后收集尿样。对尿样中19NA和19NE的浓度及同位素比进行测定。结果：服药后尿样中19NA和19NE的浓度迅速上升，其同位素比降低至接近受试品的同位素比值。结论：摄入诺龙不影响尿中孕烷二醇、雄酮、本胆烷醇酮的同位素比值。尿样在服药后27小时内提示尿样为阳性。

19-去甲雄酮；19-去甲本胆烷醇酮；同位素比质谱；兴奋剂检测

19-去甲雄酮（19-Norandrosterone，19NA）和19-去甲本胆烷醇酮（19-Noretiocholanolone，19NE）是诺龙（19-去甲睾酮）、19-去甲雄烯二酮、19-去甲雄烯二醇在人体内的主要代谢产物。它们都属于19位去甲基的类固醇激素，可以促进蛋白质的合成，运动员服用可减少脂肪贮存，增加瘦体重。19NA和19NE是世界反兴奋剂机构（World Anti-Doping Agency，简称WADA）禁用的兴奋剂[1]，其结构见图1。

图1 19-去甲雄酮和19-去甲本胆烷醇酮的化学结构

在20世纪80年代前，19位去甲基的类固醇激素被认为都是外源合成的，即体内不能产生此种物质。在此后的有关研究中，首先在马和猪等动物体内发现了内源性的诺龙，随后的研究表明，诺龙和其它19去甲基类固醇激素可以由人体自身合成和代谢的[2]。此类物质属于内源性类固醇兴奋剂。由于19NA和19NE在人体内可以自身合成，按照WADA的要求，对于它们的检测需采用气相色谱/燃烧炉/同位素比质谱（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）的方法来判断其来源。检测时，测定尿样中19NA和19NE的碳同位素比值（即δ值，单位为‰），以及内源性参照物的碳同位素比值，计算两者之间的差值，即△δ值，当该值大于3时，即表示19NA和19NE是外源性的，样本被判定为兴奋剂阳性[3]。在检测19NA和19NE时，内源性参照物可选择孕烷二醇（5β-Pregnane-3ɑ，20ɑ-diol，PD）、雄酮（An）、11-羟基雄酮等。

对19NA和19NE的检测研究主要集中在定量和来源鉴别方面。Bagchus等人研究了三种剂量的癸酸诺龙在血液及尿液中药物代谢动力学特点，确定了可以检测到19NA和19NE的时间窗口期[4]。Tseng等人对服用了营养补剂后的尿样中19NA和19NE进行了定性和定量分析研究[5]。在Baume等人的研究中，志愿者口服25 mg同位素标记诺龙，通过对尿样中19NA和19NE的定性和定量分析，探讨了诺龙在代谢过程中的个体差异[6]。另外，有研究介绍了同位素比方法检测尿样中19NA来源的实验方法[7，8]，并讨论了内源性19NA的来源。

由于饮食、地域、环境、人种等因素对同位素比值有影响，IRMS检测方法的建立应该对这些因素加以考察。应用IRMS方法对中国地域内的中国人口服诺龙的检测研究以及尿中19NA和19NE的检测研究尚未见报道。本研究针对口服诺龙后中国人的尿样中19NA和19NE兴奋剂进行同位素比检测研究。诺龙在体内可被代谢为19NA和19NE，因此可采用口服诺龙后收集尿样的方法得到具有19NA和19NE代谢信息的样本。诺龙、19NA、19NE这三者均为兴奋剂，因19NA和19NE是诺龙的代谢产物，检测19NA和19NE即是检测诺龙。如果它们在尿样中含量高，超过WADA设定的相关界限，样品为阳性，不需要采用同位素比质谱方法鉴别内源性与外源性。如果代谢物19NA和19NE在尿样中浓度低，则需要排除内源性的可能，此时采用IRMS方法鉴别来源。本研究的目的是采用IRMS方法检测口服兴奋剂诺龙及检测19NA和19NE。尿中19NA和19NE有外源性来源时，样本中An和本胆烷醇酮（Etiocholanolone，Etio）是否受到影响也在本实验中进行验证。

1 实验材料

1.1 仪器与设备

气相色谱/质谱联用仪（GC/MS）：HP6890/5973，Agilent Technologies；超纯水制备仪：Milli-Q，MILLIPORE公司；高效液相色谱仪（HPLC）：Waters 2796，Waters公司；气相色谱/燃烧炉/同位素比质谱仪（GC/C/IRMS）：DELTA PLUS，Thermo Scientific公 司。

1.2 试剂、对照品

β-葡萄糖醛酸甙酶：b-Glucuronidase from E.coli IX-A型，Sigma，美国；叔丁基甲醚[（CH3）3COCH3]：TEDIA COMPANY.INC，美国；N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-trimethylsilyltri-fluoroacetamide，MSTFA）：Sigma，美国；三甲基碘硅烷（Trimethylsilyliodide，TMSI）：Sigma，美国；二硫代赤藓糖醇（ Dithioerythritol）：Aldrich，美国。其它试剂为分析纯，由北京化工厂等提供。

19NA、19NE、An、Etio、PD、甲基睾酮（17a-Methyltestosterone，MT）、诺龙等对照品购自美国Sigma公司。受试品为装入胶囊的20 mg诺龙对照品。

2 实验步骤

2.1 试剂的制备

β-葡萄糖醛酸苷酶溶液：取β-葡萄糖醛酸苷酶适量，溶解于磷酸盐缓冲液中，配制成50000 unit/mL溶液，置4℃冰箱中保存，备用。

磷酸盐缓冲液：在0.2 M磷酸二氢钾水溶液中，加入0.2 M磷酸氢二钾水溶液，用pH计检测pH值，pH=6.9。

2.2 仪器操作条件

2.2.1 GC/MS色谱条件

色谱柱：HP-1毛细管色谱柱（17 m×0.2 mm i.d.×0.11 μm）；进样口温度：280℃；接口温度：300℃；采用恒压模式，柱压：87 kPa；分流比10∶1；进样1 mL；柱升温程序为：180℃-3.3℃ /min→231℃-30℃/min→310℃（2min）。

2.2.2 HPLC色谱条件

色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，于35分钟内，流动相由30%乙腈增加至100%乙腈。流速1 mL/min，柱温27℃。

2.2.3 GC/C/IRMS色谱条件

色谱柱：HP-5毛细管色谱柱（25 m×0.25 mm i.d.×0.33 μm）；进样口温度：260℃；采用恒流模式，柱流速为1 mL/min，不分流进样；柱温采用程序升温：180℃（2min）-6℃/min→255℃-3℃/min→285℃（5min）。

氧化炉温度为960℃；还原炉温度为600℃。

2.3 受试品同位素比值检测

采用IRMS测定诺龙受试品同位素比值。

2.4 尿样中19NA和19NE浓度测定

精密吸取2mL尿样，加入MT内标溶液，再加入1 mL磷酸盐缓冲液和50 mL β-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混匀，在55℃恒温水浴中酶解3 hr，取出。加入4 mL叔丁基甲醚振荡萃取。离心，吸取上层有机溶液，在55℃加热下用氮气吹干，加入50 mL衍生化试剂（MSTFA/TMSI/Dithioerythritol 1000∶3∶1），溶解残渣，转入样品瓶中，封盖，70℃反应30min。备用。

依据峰面积以内标法进行定量分析，并按照下列公式进行浓度的比重校正。

2.5 样品同位素比测定

取6 mL尿样，加入1 mL磷酸盐缓冲液和100 mL β-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混匀，在55℃恒温水浴中酶解3 hr，取出。加入8 mL叔丁基甲醚振荡萃取。离心，吸取上层有机溶液，在55℃加热下用氮气吹干，加入50 mL甲醇溶解残渣，转入样品瓶中，封盖，备用。依HPLC条件，及对照品的保留时间，分离并收集相关组分，并于55℃氮气流吹干。依据GC/C/IRMS条件测定待测物的同位素比值。

2.6 体内代谢研究

2.6.1 受试及尿样采集

征集2名健康男性志愿者（N1、N2）参加受试，年龄为22～25岁。志愿者受试通过伦理审查，并签署知情同意书。受试者在受试前的尿样为空白尿样（0 h）。受试者单次口服受试品1粒。在服药后收集11份尿样。尿样采集安排如下：受试后当天（第1天）留尿6份，间隔约2～3小时；第2天留尿3份，间隔约5～10小时；第3天留晨尿2份。

2.6.2 样品处理及数据分析

将采集的尿样依照上述样品制备方法进行处理，对尿中19NA和19NE、PD进行含量测定并进行19NA、19NE、An、Etio、PD同位素比值的测定，绘制尿排曲线。

3 结果与讨论

3.1 受试品诺龙同位素比值及检测方法的验证

诺龙同位素比值（‰）为-30.92 ±0.41（n=6）。

实验所用方法已通过方法验证。19NA和19NE日内精密度（‰，n=6）分别为-31.50±0.29和-30.52±0.26；日间精密度（‰，n=6）分别为-31.64 ±0.29和-30.52 ±0.09；重复性（‰，n=6）分别为-31.11 ±0.18和-31.22 ±0.22；19NA线性（300～5000 mv）RSD为1.60%；19NE线性（300～4000 mv）RSD为1.21%。

3.2 19NA和19NE浓度随时间变化规律

绘制2名受试者19NA和19NE浓度尿排曲线（见图2）。

图2 受试者尿样中19NA和19NE浓度尿排曲线

受试者服用诺龙之后，尿样中19NA和19NE浓度迅速升高。约在2小时到达最大值，之后浓度下降。此二受试者尿中19NA浓度大于19NE。 10小时后，浓度降至很低水平。此后，浓度在27小时略有升高，之后，再次降低。

3.3 19NA、19NE、An、Etio、PD同位素比值随时间变化规律

绘制2名受试者19NA、19NE、An、Etio、PD的同位素比值尿排曲线（见图3）。

受试者服药后2～13小时内及27小时尿中19NA和19NE的浓度高于检测限（2 ng/mL），对样品进行了同位素比检测，同位素比值以δ值表示，单位为‰。测定结果表明，服药后尿样中19NA和19NE的δ值保持在约-30‰，与受试品的δ值-30.92‰接近。PD作为内源性参照物，其δ值未发生变化。An和Etio的δ值未发生变化。19NA和19NE的δ值与PD的δ值的差值均大于WADA的阳性标准3‰，其与An的δ值的差值均大于3‰。An和Etio的δ值不因摄入诺龙而受影响。尿样在服药后10小时内及27小时检测为阳性。

3.4 内源性诺龙及19NA、19NE的来源

相关研究表明内源性诺龙是体内雄性激素在芳香酶的作用下向雌性激素转化时产生的[9]。诺龙可在妇女胎盘中检测到，同时在尿样也中检测到19NA的存在[10]。摄入动物脏器，可导致尿样中的19NA升高。使用炔诺酮类的药物，也会产生19NA。另有研究表明，19NA和19NE也来自An和Etio[11]。尿样中存在着19位去甲基的反应，19-去甲类固醇激素代谢物可在样品前处理过程中，由An和Etio代谢形成[12]。

图3 受试者尿样中19NA和19NE同位素比值尿排曲线

3.5 本研究在常规检测中的意义

本研究已应用于实际检测工作，填补了我国在此方面检测方法的空白。本研究一方面对所建立的相关检测方法进行了应用验证，另一方面了解了以19NA和19NE为被检测物质的诺龙的检测规律。因此，本研究对于实际检测工作具有重要意义。

4 结论

口服诺龙20 mg使尿中的19NA和19NE浓度在2小时内迅速升高，δ值与受试品的δ值接近。尿中PD、An、Etio的δ值未发生变化。尿样在服药后10小时内及27小时检测为阳性。

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Study for the Doping Control of 19-Norandrosterone and 19-Noretiocholanolone with Isotope Ratio Mass Spectrometry

Wang Jingzhu1，Yang Rui1，2，Liu Xin1
1 National Anti-Doping Laboratory，China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China
2 Beijing Sports University，Beijing 100084，China

Wang Jingzhu，Email：wangjingzhu@chinada.cn

ObjectiveThe 19-Norandrosterone（19NA）and 19-Noretiocholanolone（19NE）are endogenous steroids abused as dope.The aim of this study was to investigate the detection of 19NA and 19NE using isotope ratio mass spectrometry.MethodsTwo male volunteers were recruited.Each volunteer was orally administered a single dose of 20 mg of nandrolone，and their urine samples were collected after administration.The analyses of urinary concentrations and isotope ratios of 19NA and 19NE were performed.ResultsConcentrations of 19NA and 19NE increased rapidly after administration，and their isotope ratios decreased to the value of the drug ingested.ConclusionThe intake of nandrolone has no effect on the isotope ratios of pregnanediol，androsterone and etiocholanolone.The urine samples were positive within 27 hours after administration.

19-norandrosterone，19-noretiocholanolone，IRMS，doping test

2017.03.25

国家体育总局重点研究领域攻关课题（2013B003）

王静竹,Email：wangjingzhu@chinada.cn