山羊附睾头细胞转染中新霉素和嘌呤霉素的浓度筛选

邰苗苗，吴小叶，杜海燕，孟繁荣，张春香，任有蛇

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.朔州市平鲁区畜牧兽医局，山西平鲁036800）

山羊附睾头细胞转染中新霉素和嘌呤霉素的浓度筛选

邰苗苗1，吴小叶2，杜海燕1，孟繁荣1，张春香1，任有蛇1

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.朔州市平鲁区畜牧兽医局，山西平鲁036800）

通过对9月龄黑山羊附睾头细胞进行不同浓度、不同时间新霉素和嘌呤霉素的处理，收集各个时间的细胞并进行计数，旨在研究山羊附睾头细胞对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度。结果显示，山羊附睾头细胞在转染时对新霉素和嘌呤霉素适宜的质量浓度分别为400，2 μg/mL；试验细胞计数结果与细胞生长状态相一致，山羊附睾细胞与其他哺乳动物不同组织器官对新霉素和嘌呤霉素的耐受浓度基本一致。研究结果可为后期基因敲除和过表达载体转染进山羊附睾头细胞时抗性基因浓度的确定提供了参考，也为后期基因功能的研究奠定了基础。

山羊附睾头细胞；新霉素；嘌呤霉素

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用黑山羊饲养于山西农业大学动物科技学院试验基地，以9月龄公羊附睾头细胞作为试验材料。

1.2 主要试剂

细胞培养基DMEM/F12，无菌PBS，胰蛋白酶，青链霉素混合液，HEPES液（博士德生物公司）；嘌呤霉素（美国Sigma公司），新霉素（即G418，美国Amresco公司），胎牛血清（澳洲Gibco公司生产，购自北京博雅宏兴科技发展有限公司），Guava Via-Count Reagent（北京强欣博瑞生物技术有限公司），GuavaRInstrument Cleaning Fluid（北京强欣博瑞生物技术有限公司）。

1.3 试验方法

将传代至第3～4代对数生长期的山羊附睾头细胞以50%密度铺到96孔板中，换上含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基，每孔添加100 μL细胞悬液，置于含5%CO2的37℃无菌恒温培养箱培养。24 h后分别更换添加新霉素的不含青链霉素培养基，使其在细胞培养液的终质量浓度分别为 0，50，100，200，400，600，800 μg/mL，每2 d换一次添加新霉素的培养基，每组 15 个重复，分别于 48，96，120，144，168 h 消化添加不同浓度新霉素的3个孔。采用Guava EasyCyte流式细胞仪进行活细胞计数，选择7～10 d细胞全部死亡的新霉素浓度为筛选浓度。

筛选嘌呤霉素时，添加不同浓度的嘌呤霉素，使嘌呤霉素的终质量浓度分别为 0，1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μg/mL，每2 d换一次添加嘌呤霉素的培养基，每组9个重复，分别于24，48，72 h后消化添加不同浓度的嘌呤霉素的3个孔，采用Guava EasyCyte流式细胞仪进行活细胞计数，选择3～4 d细胞全部死亡的嘌呤霉素浓度为筛选浓度。

2 结果与分析

2.1 不同新霉素浓度对附睾头活细胞的抑制效果

表1 不同新霉素浓度对附睾头活细胞数目的影响（平均值） 个

试验结果显示，新霉素处理48 h后，处理组质量浓度为800 μg/mL时，细胞并未全部死亡，在使用新霉素处理细胞96，120 h后，细胞对新霉素的耐受质量浓度分别为600，400 μg/mL；新霉素处理144，168 h后，细胞对新霉素的耐受质量浓度均为200 μg/mL（表 1）。

在培养过程中，将新霉素处理过后每个时间段的细胞状态都进行拍照保存。图1为新霉素终质量浓度为200 μg/mL的细胞0～7 d的生长状态。从图1可以看出，最初新霉素对附睾头细胞未产生抑制效果，随着添加新霉素时间的延长，活细胞越来越少，细胞形态也有所变化。在添加新霉素144 h后，细胞形态异常，细胞全部变圆，未呈现正常的鹅卵石状，且细胞核增大，细胞质变浑浊。

2.2 不同嘌呤霉素浓度对附睾头活细胞的抑制效果

从表2可以看出，嘌呤霉素处理附睾头细胞24 h后，不同质量浓度的嘌呤霉素能够杀死部分细胞，但即使嘌呤霉素质量浓度高达10 μg/mL，也未能使细胞全部死亡；嘌呤霉素处理附睾头细胞48 h后，5.0 μg/mL的嘌呤霉素组细胞就已全部死亡；嘌呤霉素处理附睾头细胞72 h后，细胞对嘌呤霉素的耐受质量浓度是1.0 μg/mL。

表2 不同嘌呤霉素质量浓度对附睾头活细胞数目的影响（平均值） 个

在添加不同质量浓度的嘌呤霉素之后，不同时间段细胞状态不同。图2为嘌呤霉素终质量浓度为1 μg/mL时0～3 d细胞的生长状态。由图2可知，随着时间的延长，维持正常形态的细胞数越来越少，添加1 μg/mL嘌呤霉素72 h后，细胞形态异常，细胞全部变圆，细胞核变大，不再是鹅卵石样的细胞。

3 讨论

利用基因敲除模型和基因过表达模型，借助序列分析平台探究未知蛋白的功能是科学家对基因研究常用的方法[10]。基因的敲除和过表达需要以质粒作为载体[11]，转染进山羊附睾头细胞中对目的基因进行剪切或者过量表达。细胞转染分为瞬时转染和稳定转染[12]，本研究构建基因敲除模型和过表达模型是为了将外源基因整合到真核细胞基因组中，使基因被敲除的细胞和基因过量表达的细胞能够稳定传递给后代细胞。转染细胞的打靶载体一般会以腐草霉素、嘌呤霉素、潮霉素和新霉素等作为正筛选基因[9]。真核细胞中表达新霉素抗性基因的细胞能够在含有新霉素的培养液中正常生长，而没有表达新霉素抗性基因的细胞，则会被新霉素抑制细胞的生长，从而导致细胞的死亡，这样转染成功的细胞就会被留下来，而转染失败的阴性细胞在筛选过程中就会死亡，不会对细胞模型的稳定遗传造成影响。

新霉素（Neomycin）是一种水溶性抗生素，属于2-脱氧胺氨基糖苷类抗生素[13]，其主要作用于细菌30S亚单位，抑制蛋白质的合成，从而杀死细菌[14]；对于真核细胞，主要通过破坏细胞内的溶酶体来损坏细胞[15]。而嘌呤霉素则是使DNA链断裂，它与50S亚基A部位结合，抑制氨酰-tRNA的进入，从而引起肽链合成的过早终止，一般2 d左右即可开始发挥作用[9]。由此看来，新霉素对细胞的破坏需要较长时间才能够使细胞全部死亡，而嘌呤霉素作用时间就相对较短，这与本试验结果相吻合。有研究表明，人足细胞嘌呤霉素筛选质量浓度为1.5 μg/mL[16]或1 μg/mL[17]；人乳腺癌BT549细胞嘌呤霉素筛选质量浓度为3 μg/mL[18]；人牙髓干细胞嘌呤霉素筛选质量浓度为2 μg/mL[19]；小鼠胚胎干细胞对新霉素的筛选质量浓度为400 μg/mL[20]；山羊胎儿成纤维细胞对新霉素的筛选质量浓度为400 μg/mL[12]，本研究在山羊附睾头细胞上得到的结果与之基本一致。

4 结论

本试验结果表明，新霉素处理细胞第7天，细胞全部死亡的质量浓度为200μg/mL，嘌呤霉素处理第3天，细胞全部死亡的质量浓度为1 μg/mL。为保证筛选阶段未转染细胞能够全部死亡，将其筛选质量浓度变为原来的2倍[3]，即新霉素筛选质量浓度为 400 μg/mL，嘌呤霉素筛选质量浓度为 2 μg/mL。

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Screening of Neomycin and Puromycin Concentration in Transfection of Goat Epididymal Caput Cells

TAI Miaomiao1，WU Xiaoye2，DU Haiyan1，MENG Fanrong1，ZHANG Chunxiang1，REN Youshe1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Pinglu District Shuozhou City，Pinglu 036800，China）

This research was designed to study the tolerance of goat epididymal cells to neomycin and puromycin.The cells of different time were collected and counted at different concentrations of neomycin and puromycin.The results showed that the appropriate concentrations of goat epididymal cells to neomycin and puromycin were 400,2 μg/mL,respectively.The results of this test cell count consistent with the cell growth status,and the tolerance to neomycin and puromycin of goat epididymal cells and other mammalian cells of different tissues and organs was consistent.The results of this study will provide a reference for gene knockout and the determination of resistance genes of overexpression vector transfection into the goat epididymal cells,and to provide a basis for the study of the gene function.

goat epididymal caput cells;neomycin;puromycin

S814

A

1002-2481（2017）10-1691-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.28

黑山羊是山西优良的地方山羊品种，具有适应性强、耐粗饲、易抓膘、抗病抗逆、肉质好等特点[1]。为了深入研究黑山羊的繁殖性能，在对山羊睾丸和附睾头差异表达基因的分析中发现，与睾丸相比，附睾头中表达量上调比例最大的前10位基因中有7个是β防御素，其中，山羊β防御素124（Goat beta-defensin 124，gDB124）基因的上调比例最高[2]。为了深入研究β防御素124在山羊附睾头中的功能，本研究对山羊附睾头细胞进行体外培养，分别构建了gDB124敲除载体和gDB124过表达载体。为了筛选基因成功敲除及过表达的细胞，需要对载体上的抗性基因细胞耐受浓度进行初步筛选[3]。

动物细胞的培养开始出现于20世纪，其目前已成为生物、医学研究及应用中广泛采用的一种方法[4]。睾丸中产生的精子是不具备受精能力的[5]，其是在附睾微环境中获得运动能力和受精能力的，因此，附睾上皮细胞的培养，需要考虑附睾管腔内附睾液和精子等因素[6]。附睾体外模型的建立是从1995年大鼠附睾上皮的培养开始发展并逐渐成熟起来的[7]。

本研究中过表达载体上的抗性基因为新霉素，敲除载体上的抗性基因为嘌呤霉素。由于抗生素对具有耐药性的真核细胞筛选的浓度不同[8]，不同细胞系对嘌呤霉素和新霉素的耐受度不同。即使是同种抗生素，不同厂家及批次的抗生素浓度也可能存在差异[9]。如果抗生素浓度过高，会对敲除成功的细胞产生抑制甚至是杀死细胞，造成阳性细胞过少，效率低下；如果抗生素浓度过低，则不能充分抑制未转染成功的细胞，造成假阳性。为了避免不同细胞系之间的耐受差异，并保证试验结果的准确性，本研究需要对嘌呤霉素和新霉素的筛选浓度进行测试。

2017-05-12

国家自然科学基金项目（31572407）；山西省研究生教育创新项目（2017SY036）

邰苗苗（1993-），女，山西临汾人，在读硕士，研究方向：动物遗传育种与繁殖。任有蛇为通信作者。