HPLC指纹图谱结合主成分分析对不同产地头顶一颗珠质量的评价

陈洁，陈文茜，郭文鼎，雷滔，欧阳俊摇，赵晖，邹海艳



HPLC指纹图谱结合主成分分析对不同产地头顶一颗珠质量的评价

陈洁1，2，陈文茜1，郭文鼎1，雷滔1，欧阳俊摇1，2，赵晖1，2，邹海艳1，2

1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069

通过HPLC指纹图谱结合主成分分析（PCA）对不同产地头顶一颗珠药材的质量进行评价，为其质量控制提供依据。采用Hibar C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为203 nm，柱温为30 ℃，利用相似度评价软件和PCA对14批头顶一颗珠药材检测结果进行分析比较。HPLC指纹图谱的方法学考察符合相关要求，共标定了头顶一颗珠药材HPLC指纹图谱的15个共有峰，14批药材的相似度为0.389～0.979。PCA结果显示前3个主成分的累积方差贡献率为87.674%，S2样品综合得分最高（4.926）、质量最好。所建立的HPLC指纹图谱结合PCA可以客观、有效地评价不同产地头顶一颗珠药材的质量。

头顶一颗珠；指纹图谱；高效液相色谱法；主成分分析；相似度分析

头顶一颗珠，又名芋儿七，为百合科延龄草属植物延龄草Maxim.的干燥根和根茎，主要分布于我国陕、川、鄂、湘等地，是土家族、苗族等少数民族常用药材。据《土家族药物志》记载，头顶一颗珠性平，味甘，有小毒，功能镇静止痛、散瘀疗伤、活血调经和止血[1]，是土家族四大神药（文王一支笔、江边一碗水、七叶一枝花、头顶一颗珠）之一。现代研究表明，头顶一颗珠具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、促凝血、增强心脏功能、免疫调节、抗氧化、抗衰老等药理活性，主要用于治疗眩晕、头痛、失眠、神经衰弱、脑震荡后遗症、高血压、跌打损伤、腰腿疼痛、外伤出血等症[2]。头顶一颗珠中的主要有效成分为甾体皂苷类化合物，包括重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ及头顶一颗珠皂苷等，此外，还含有倍半萜类、黄酮类等成分[3-4]。

指纹图谱是中药质量控制的重要方法，其中含有大量信息，如何有效挖掘数据、合理解析和表达指纹特征是该技术应用的关键。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种化繁为简的多元统计方法，通过降维处理，根据贡献率的大小，选择少数几个具有代表性的综合指标（主成分）代替多个原始变量，可以最大限度地保留样本的原始信息并对样本做出整体性评价[5]。近年来，PCA与指纹图谱技术相结合，已应用于清热解毒注射液[6]、雷公藤[7]、板蓝根[8-9]等中药质量评价。本试验建立头顶一颗珠药材的HPLC指纹图谱，并利用中药色谱指纹图谱相似度评价及PCA对不同产地的14批药材进行综合比较，旨在反映不同产地头顶一颗珠药材质量的一致性情况，为其质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Aglient1260高效液相色谱仪，美国安捷伦有限公司；BSA124S-CW型电子天平，奥多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ3200E型超声波清洗仪器，昆山市超声仪器有限责任公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海知信实验仪器技术有限公司。

重楼皂苷Ⅵ对照品（批号MUST-14071904）、重楼皂Ⅶ对照品（批号MUST-13080302），成都曼思特生物科技有限公司中国科学院成都生物研究所，HPLC纯度≥98%；偏诺皂苷元-3-O---吡喃鼠李糖基-(1→4)-[--吡喃鼠李糖基-(1→2)]---葡萄糖苷（PRRG）对照品，本实验室自制，HPLC纯度≥95%；甲醇为分析纯（北京化工厂），乙腈为色谱纯（Fisher Scientific），水为娃哈哈纯净水。

14批市售头顶一颗珠药材分别购自安徽亳州药材市场、河北安国药材市场、湖北恩施中药材有限公司、保真堂生物科技有限公司，产地分别为东北1（S1）、东北2（S2）、西藏1（S3）、陕西（S4）、安徽（S5）、浙江（S6）、四川（S7）、湖北（S8）、云南大理（S9）、云南（S10）、吉林（S11）、西藏2（S12）、湖北神农架（S13）、吉林长白山（S14），经首都医科大学中医药学院李佳副教授鉴定，均为百合科延龄草属植物延龄草Maxim.的干燥根和根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Hibar C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～28%A；10～15 min，28%～29%A；15～25 min，29%～65%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 µL。

2.2 供试品溶液的制备

样品粉碎，过40目筛，取药材粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，精密称定，超声提取1 h（功率1200 W，频率35 kHz），放冷，补足减失的质量，提取液用0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 混合对照品溶液的制备

分别取重楼皂苷Ⅶ、Ⅵ和PRRG对照品适量，加70%甲醇溶解并制成浓度分别为1.2、1.1、2.1 mg/mL的对照品溶液，用0.45 µm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定，以重楼皂苷Ⅵ色谱峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.07%，相对峰面积的RSD均小于2.0%，所得色谱图的相似度分别为0.984、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999，RSD＝0.61%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，以重楼皂苷Ⅵ色谱峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.05%，相对峰面积的RSD均小于3.25%，所得色谱图的相似度分别为0.991、0.987、0.999、0.998、0.999、0.997、0.997，RSD＝0.45%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取同一批药材，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以重楼皂苷Ⅵ为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.09%，相对峰面积的RSD均小于1.98%，所得色谱图的相似度分别为0.999、0.998、1.000、0.999、0.999、0.999，RSD＝0.06%，表明本方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

按上述色谱条件对14批不同产地的头顶一颗珠药材进行测定，所得HPLC指纹图谱见图1。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723版）对14批头顶一颗珠药材的色谱图进行处理，以S8药材样品作为参照，通过多点校正，取中位数法生成HPLC共有模式图（见图2）。通过比对，确定了15个共有特征峰，其中12号峰为重楼皂苷Ⅶ，13峰为PRRG，14号峰为重楼皂苷Ⅵ。由图2可知，重楼皂苷Ⅵ色谱峰分离度好，峰面积最大，峰位适中，为所有供试品共有，因此选定14号峰为参比峰（S）。

2.6 相似度评价

对14批不同产地头顶一颗珠样品的指纹图谱进行比较分析，结果15个共有峰相对保留时间RSD在0.01%～1.24%范围内，相对峰面积RSD在17.31%～212.23%之间。采用相似度软件进行分析，其相似度结果在0.389～0.979之间（见表1），表明不同产地头顶一颗珠的质量存在较大差异。

图1 14批不同产地头顶一颗珠HPLC指纹图谱

注：12.重楼皂苷Ⅶ；13.PRRG；14.重楼皂苷Ⅵ

表1 14批不同产地头顶一颗珠相似度评价（r）

2.7 主成分分析

采用SPSS19.0统计软件对14批不同产地头顶一颗珠药材的HPLC指纹谱图数据进行主成分分析。相关系数矩阵见表2。当＞0.8时，说明2个变量间存在高度正相关。可见，成分2和成分3、4、6间存在较高正相关，成分3与成分4、10间存在较高正相关，成分4与成分6、9、10、12、13、14、15间存在较高正相关，成分6和成分7、9、10、12、13、14之间存在较高正相关，成分8和成分9、10、12、13、14间存在较高正相关，成分9和成分10、12、13、14间存在较高正相关，成分10和成分12、13、14间存在较高正相关，成分12和成分13、14间存在较高正相关，成分13与成分14间存在较高正相关。

主成分特征值及贡献率见表3，主成分矩阵见表4。取特征值＞1作为提取标准，获得前3个主成分的累积方差贡献率为87.674%（＞85%），由此确定选取前3个主成分作为评价标准，集中代表了头顶一颗珠药材中15个成分87.674%的信息量。根据表3、表4可知，主成分1的特征值为9.712，累积方差贡献率为64.745%，成分2、3、4、6、7、8、9、10、12、13、14这11个成分在主成分1有较高的载荷，说明主成分1能反映这11种成分的信息；同理依次分析主成分2、3。以主成分为变量，结合表4数据得到主成分载荷图（见图3）。可见，距离原点较远的点为主成分1、2中载荷较高的成分，说明这几个成分在头顶一颗珠药材质量评价中起决定性作用。

利用上述3个主成分对不同产地头顶一颗珠药材质量进行评价，计算各批药材中3个主成分的单独得分和综合得分，结果见表5。可见，14批样品的综合得分在4.926～-3.645之间，表明各批药材质量存在较大差异，其中S2样品综合得分最高（4.926）、质量最好，而S5样品的综合得分最低（-3.645）、质量较差。3个主成分中，主成分1、2、3分别在8、4、2批药材的综合得分中占有较高的权重，主成分1所代表的11种成分与头顶一颗珠药材的质量存在较高的相关性。

表2 15个成分相关系数矩阵（r）

表3 主成分初始特征值及贡献率

表4 主成分矩阵

图3 主成分载荷图

表5 各主成分得分及综合得分

3 讨论

目前对头顶一颗珠药材的质量评价方法主要有含量测定和指纹图谱方法[10-11]。本研究建立了头顶一颗珠药材的HPLC指纹图谱，方法学考察表明，此法可用于评价不同产地药材质量的一致性。重楼皂苷Ⅵ是头顶一颗珠的主要化学成分，较其他皂苷的含量高，因此选择重楼皂苷Ⅵ作为参比峰。各产地药材图谱中的共有峰相对保留时间基本一致，但相对峰面积差异较大，反映了不同产地头顶一颗珠的有效成分含量存在明显差异。对14批不同产地药材的相似度分析表明，S1与对照图谱的相似度最高，而S6与其他产地样品存在较大差异。通过对共有峰主成分的标定与分析得到不同产地头顶一颗珠的综合得分，结果显示，S2综合得分最高、质量最好，S5得分最低。相似度分析与PCA结果存在明显差异，主要原因在于相似度分析是对所有色谱峰进行对比分析，而PCA是将15个共有峰变量转换为3个主要变量进行比对。相似度分析能更直观地显示样品与对照图谱存在的差异或其一致性，而PCA新生成的主成分具有代表性、独立性和全面性，对这几个主成分进行综合分析对于评价药材的质量具有一定的合理性和客观性。

[1] 方志先,赵晖,找敬华.土家族药物志[M].北京：中国医药科技出版社, 2007：371-372.

[2] 李志勇,周凤琴,图雅,等.土家族药头顶一颗珠现代研究进展[J].中国中医药信息杂志,2011,18(1)：104-106.

[3] 廖朝林,郭汉玖,刘海华,等.延龄草研究综述[J].安徽农业科学, 2008,36(6)：2478-2479,2543.

[4] 欧阳俊摇,邹海艳,李慢中,等.延龄草的化学成分和药理作用研究进展[J].时珍国医国药,2016,27(2)：433-437.

[5] 孔浩,郭庆梅,王慧慧,等.主成分分析法在中药质量评价中的应用[J].辽宁中医杂志,2014,41(5)：890-892.

[6] 孙国祥,史香芬,赵新.清热解毒注射液统一化HPLC指纹图谱的评价[J].沈阳药科大学学报,2009,26(4)：293-298.

[7] 张茹萍,何昱,石森林,等.HPLC指纹图谱结合主成分分析评价不同产地雷公藤药材质量[J].中国现代应用药学,2014,31(11)：1338-1344.

[8] 肖珊珊.板蓝根化学成分与多维指纹图谱研究[D].沈阳：沈阳药科大学,2007.

[9] 尚晓娜,宋平顺,李士博,等.板蓝根中3种核苷成分的多波长HPLC测定及主成分分析[J].中成药,2012,34(9)：1752-1755.

[10] 孙艳平,汪兴军,张寒,等.延龄草提取物HPLC指纹图谱研究[J].中药新药与临床药理,2016,27(5)：681-683.

[11] 柴江,王欣,杨芳,等.延龄草药材质量评价方法的研究[J].中国药学杂志,2014,49(24)：2150-2154.

Evaluation of Quality Coherence ofMaxim. from Different Producing Areas Based on HPLC Fingerprint and PCA

CHEN Jie1,2, CHEN Wen-xi1, GUO Wen-ding1, LEI Tao1, OUYANG Jun-yao1,2, ZHAO Hui1,2, ZOU Hai-yan1,2

To evaluate the quality coherence ofMaxim. from different producing areas by HPLC fingerprint and PCA; To provide a method for quality control.Samples were separated by Hibar C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) with acetonitrile-water as gradient mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min. The wavelength was 203 nm and the temperature was 30 ℃. Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System and PCA were used to analyze the data.The results of method validation of HPLC fingerprint met technical standards. 15 common peaks was verified and the similarities of 14 batches ofMaxim. from different producing areas were among 0.389–0.979. 3 principal components with the characteristic root cumulative contribution rate reaching 87.674% were screened out by PCA results. The composite score of S2 was the highest (4.926), and the quality was the best.The application of HPLC combined with PCA can objectively and effectively evaluate the quality difference ofMaxim. from different producing areas.

Maxim.; fingerprint; HPLC; principal component analysis; similarity analysis

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.014

R284.1

A

1005-5304(2017)11-0058-05

（2017-04-10）

（2017-07-02；编辑：陈静）

北京市教育委员会科技发展计划面上项目（KM201510025011）；北京市属高等学校青年拔尖人才培育计划（CIT&TCD201404175）

邹海艳，E-mail：bwzhy@sina.com