实时荧光定量PCR技术在侵袭性真菌感染诊断中的应用价值

马晓薇 李 明 李庆伦 张慧婷 罗彩琴

(宁夏医科大学总医院心脑血管病院ICU，宁夏 银川 750012)

1 宁夏医科大学

实时荧光定量PCR技术在侵袭性真菌感染诊断中的应用价值

马晓薇 李 明1李庆伦1张慧婷 罗彩琴

(宁夏医科大学总医院心脑血管病院ICU，宁夏 银川 750012)

目的探讨实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)技术在侵袭性真菌感染(IFI)诊断中的应用价值。方法采集IFI高危患者102份血清,收集其相关临床资料。以“重症患者IFI的诊断和治疗指南(2007年)” 作为金标准，计算RTFQ-PCR和G试验的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。 以血培养为金标准，计算 RTFQ-PCR的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。结果根据“2007年指南”的诊断标准，确诊病例2例，临床诊断病例20 例，拟诊病例31例，非IFI病例49例。以确诊和临床诊断病例作为感染组，非IFI病例作为非感染组。两组年龄、慢性肾功能不全、糖尿病、预后差患者的比例比较均有统计学差异(P<0.05)。IFI感染部位主要为呼吸道感染10例(50.0%)、泌尿感染8例(40.0%)、血液感染2例(10.0%)。在24例IFI患者中共分离出17株真菌，分别为9株白色念珠菌(52.9%)，1株热带念珠菌(5.9%)，3株光滑念珠菌(17.6%)，2株念珠菌属(11.8%)，2株烟曲霉(11.8%)。以“2007年指南”作为金标准，RTFQ-PCR灵敏度为50.0%，特异度为95.9%，阳性预测值为81.8%，阴性预测值为83.9%；G试验的敏感度为61.1%，特异度为91.8%，阳性预测值为73.3%，阴性预测值为 86.5%。以血培养为金标准，RTFQ-PCR的敏感度为100.0%，特异度为88.2%，阳性预测值为15.4%，阴性预测值为100.0%。结论RTFQ-PCR检测技术可以作为重症患者IFI早期诊断的一种有效手段，在临床上对IFI的早期诊断具有一定的价值。

侵袭性真菌感染；实时荧光定量PCR技术；诊断

目前镜检是临床上最常用的诊断侵袭性真菌感染(IFI)的方法，但其敏感度低，培养方法周期较长，检出率不高。临床上诊断IFI的金标准是组织病理学检查，由于需有创取材，患者难以接受。影像学检查缺少特异性，血清学检查G试验虽然弥补了传统诊断手段的一些缺点，但假阳性、假阴性高〔1〕。实时荧光定量PCR技术(RTFQ-PCR )耗时短，污染少，敏感度和特异度高，能够为IFI的早期诊断提供帮助〔2〕。但对于重症患者IFI的诊断价值尚不清楚。在重症监护病房(ICU)，侵袭性白色念珠菌感染(ICI)在IFI中占50%左右，本研究拟评价RTFQ-PCR技术在重症患者ICI早期诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取宁夏医科大学总医院及心脑血管病医院ICU科2015年5月至2016年3月102例IFI高危患者，纳入标准：①入住ICU时间≥24 h；②年龄≥18周岁；③经抗菌素抗感染治疗72 h后仍有感染迹象。排除标准：①入ICU前已使用抗真菌药物治疗；②临床拟诊断其他真菌感染的患者。患者或家属知情同意并签署知情同意书，本研究在医院伦理委员会批准下实施。其中男70例，女32例，年龄22～89〔平均(63.83±15.32)〕岁。

1.2研究方法 收集研究对象的相关临床资料，包括一般情况、危险因素、基础疾病、实验室检查、组织病理、影像学及预后等临床资料。血清标本的收集：采集研究对象的血清，保存于-80℃冰箱，留作进一步PCR检测。相关实验室检测：送检血培养、G试验，收集其结果。血培养和G试验均由宁夏医科大学总医院检验科进行检测。

1.3PCR检测

1.3.1RTFQ-PCR检测 引物和探针购自生工公司。上游引物：5'-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3'；下游引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；TapMan探针：5'-FAM-ATTGCTTGCGGCGGTAACGTCC-TAMRA-3'。先按照Biospin试剂盒说明书进行白色念珠菌标准株基因组DNA的提取，后进行白色念珠菌阳性标准品的制备，包括普通PCR扩增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，采用AxyPren DNA试剂盒进行胶回收，将回收的基因片段通过电泳进行鉴定。如确定为目的片段后，将回收的目的片段送昆泰锐生物技术有限责任公司进行测序，进一步验证。将上述提取的白色念珠菌目的基因片段作为阳性标准品，经ND-1000分光光度仪测定其浓度，判断其纯度，根据拷贝数计算公式计算出标准品的拷贝数。再行白色念珠菌RTFQ-PCR扩增，将回收的基因片段作为标准品，给予10倍梯度的倍比稀释，通过计算得到拷贝数，进行扩增，获得各自CT值，选取其中线性关系最好的5个梯度，由软件绘制出标准曲线。IFI高危患者血清DNA的提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒，按实验说明进行。最后进行血清标本DNA的RTFQ-PCR检测，每次实验设立5组标准品，提取健康人血清的DNA作为阴性对照，将双蒸水作为空白对照，每个样本均3个复孔。

1.3.2普通PCR检测 引物为1.3.1的引物，建立反应体系，提取健康人血清的DNA作为阴性对照，将双蒸水作为空白对照，采用全式金公司的Agarose，按照说明书操作进行普通PCR产物的鉴定。

1.4观察指标 分析IFI高危患者的临床资料：年龄、性别、基础疾病、ICU住院时间、预后；以“2007年重症患者IFI的诊断和治疗指南” 为金标准，分析评价RTFQ-PCR、G试验的诊断价值；以血培养为金标准，分析评价RTFQ-PCR的诊断价值。

1.5统计学方法 应用SPSS2.0统计学应用软件进行χ2及t检验。

2 结 果

2.1一般资料 根据“2007年指南”的诊断标准，确诊病例2例，临床诊断病例20 例，拟诊病例31例，非IFI病例49例。以确诊和临床诊断病例作为感染组，非IFI病例作为非感染组。两组年龄、慢性肾功能不全、糖尿病、预后差(死亡或放弃)患者的比例均有统计学差异(P<0.05)。见表1。

2.2ICU中IFI感染部位分布情况和真菌种属分布 IFI感染部位主要为呼吸道感染10例(50.0%)、泌尿感染8例(40.0%)、血液感染2例(10.0%)。IFI患者中共分离出17株真菌，分别为9株(52.9%)白色念珠菌，1株(5.9%)热带念珠菌，3株(17.6%)光滑念珠菌，2株(11.8%)念珠菌属，2株(11.8%)烟曲霉。

表1 两组一般资料比较〔n(%)〕

2.3白色念珠菌RTFQ-PCR检测结果分析 102份病例,2例烟曲霉感染，3例光滑念珠菌感染，2例热带念珠菌感染，根据排除标准，排除这7份标本后，最终纳入95份标本。其中RTFQ-PCR阳性13例(13.7%)。2例确诊病例2例阳性，16例临床诊断病例7例阳性，28例拟诊病例 2例阳性，49例非IFI病例 2例阳性。白色念珠菌RTFQ-PCR检测结果为2例确诊病例2阳性，16例临床诊断病例7例阳性，49例非IFI病例 2例阳性。RTFQ-PCR阳性时，2007年指南检测阳性9例，阴性2例；RTFQ-PCR阴性时，2007年指南检测阳性9例，阴性47例。RTFQ-PCR灵敏度为50.0%，特异度为95.9%，阳性预测值为81.8%，阴性预测值为83.9%。

2.4普通PCR检测结果 本实验纳入102份病例，其中，仅2例确诊病例检测结果为阳性，余病例均为阴性。

2.5G试验结果 95份标本中G试验阳性为29例(30.5%)，其中2例确诊病例1例阳性，16例临床诊断病例10例阳性，28例拟诊病例14例阳性，49例非IFI病例4例阳性。以“2007年指南”作为金标准，G实验阳性，2007年指南阳性11例，阴性4例，G实验阴性，2007年指南阳性7例，阴性45例。G试验的敏感度为61.1%，特异度为91.8%，阳性预测值为73.3%，阴性预测值为 86.5%。

2.6以血培养为金标准白色念珠菌RTFQ-PCR检测结果 血培养结果为2个确诊病例为阳性，其他病例均为阴性。以血培养为金标准，RTFQ-PCR阳性，血培养阳性2例，阴性11例；RTFQ-PCR阴性，血培养阴性0例，阴性82例，白色念珠菌 RTFQ-PCR的敏感度为100.0%，特异度为88.2%，阳性预测值为15.4%，阴性预测值为100.0%。

3 讨 论

在ICU中严重感染问题依然非常棘手，重症感染患者的死亡率依然未得到有效控制，IFI就是其中重要组成部分。由于重症患者病情危重且侵入性操作多导致IFI的发生率更高，目前在ICU病房中，IFI占院内感染的8%～15%〔2〕，其中白色念珠菌比例依然较高。IFI的危险因素包括接受免疫抑制剂治疗、大剂量激素治疗、长期应用广谱抗菌素，各种侵入性操作、接受器官移植患者及患者年龄>65岁、慢性肾功能不全、糖尿病、存在念珠菌定植等。独立危险因素有APACHEⅡ评分>22分、年龄>65岁、患有慢性肾功能不全、广谱抗菌素长期使用、多次入住重症监护室等〔3〕。本研究提示IFI患者的基础疾病较非IFI患者的基础疾病更多，且患有IFI的患者病死率高，而且预后差。ICI在IFI中占多数，而白色念珠菌感染占40%～60%〔4〕。本研究与上述研究的结果一致。

目前临床上常用的诊断手段不能快速、准确的做出诊断，影响早期诊断和治疗，是造成IFI病死率高，治疗费用昂贵的因素之一。TaqMan探针RTFQ-PCR技术具有耗时短、污染少、敏感度、特异度高和重复性好的特点。本次研究所采用的TaqMan探针为白色念珠菌专属性探针，检测标本为IFI高危患者血清。将研究对象分为确诊IFI、临床诊断IFI、拟诊IFI及非IFI。本研究结果提示RTFQ-PCR在ICI的早期诊断中有一定的应用价值。在本次研究中白色念珠菌RTFQ-PCR灵敏度为50.0%，分析其原因：本实验采用临床诊断标准作为金标准，纳入的感染组病例可能并非全是白色念珠菌感染，因此影响了RTFQ-PCR的敏感性。另外RTFQ-PCR在IFI的诊断中有一定价值。普通PCR的引物为真菌广谱性引物，能够检测绝大多数真菌病原体。有文献报道，RTFQ-PCR的敏感度为普通PCR的数倍〔5〕。在临床上，真菌血培养阳性，可确诊为IFI，因此以血培养为金标准，来评价白色念珠菌RTFQ-PCR的诊断价值〔6〕。本实验结果与相关研究结果相似〔7〕。相对于3～5 d才能出结果的传统血培养，RTFQ-PCR不仅检测速度快，敏感度高，能够鉴定种属，而且还可以对真菌DNA进行量化检测〔8〕。可在一定程度上提高ICI的早期诊断率，为早期治疗ICI提供更加充分的依据。

1柳明波,韦良宏.艾滋病合并侵袭性真菌感染早期检测的研究进展〔J〕.国际检验医学杂志,2014；35(6):713-5.

2Chong GL,van de Sande WW,Dingemans GJ,etal.Validation of a new Aspergillus real-time PCR assay for direct detection of Aspergillus and azole resistance of Aspergillus fumigatus on bronchoalveolar lavage fluid〔J〕.J Clin Microbiol,2015;53(3):868-74.

3中华医学会重症医学分会.重症患者侵袭性真菌感染诊断与治疗指南(2007)〔J〕.中华内科杂志,2007;46(11):960-6.

4钟明媚,张 琳,张 金,等.重症监护病房患者侵袭性真菌感染现状分析〔J〕.安徽医药,2014;18(7):1258-61.

5Foongladda S,Mongkol N,Petlum P,etal.Multi-probe real-time PCR identification of four common Candida species in blood culture broth〔J〕.Mycopathologia,2014;177(5-6):251-61.

6Schell WA,Benton JL,Smith PB,etal.Evaluation of a digital microfluidic real-time PCR platform to detect DNA of Candida albicans in blood〔J〕.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012;31(9):2237-45.

7Hayden RT,Gu Z,Ingersoll J,etal.Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus〔J〕.J Clin Microbiol,2013;51(2):540-6.

8劳庆禄,邓文成,刘洁芬,等.检测(1,3)-β-D葡聚糖对早产儿侵袭性真菌感染的诊断〔J〕.中国热带医学,2015;15(4):483-5.

2015年第二批宁夏回族自治区科技支撑计划项目(No.XT201418)；宁夏医科大学2014年度校级科研项目(No.宁医校发〔2014〕253号)

马晓薇(1970-)，女，博士，主任医师，主要从事重症感染与急性呼吸衰竭研究。

R445

A

1005-9202(2017)20-5119-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.074

〔2017-03-21修回〕

(编辑 袁左鸣)