胚胎干细胞自我更新与诱导分化

李向东，王秀丽

(1.大连医科大学附属第二医院 心血管内科，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学 基础医学院 组织胚胎学教研室，辽宁 大连 116044)

国家自然科学基金项目(31470952)；辽宁省自然科学基金项目(2014023003，2014023018)

李向东( 1968-)，男，教授。E-mail: 997993099@qq.com

王秀丽，教授，研究方向：组织工程与再生医学。E-mail: panpan1210@dicp.ac.cn

专家述评

10.11724/jdmu.2017.05.01

胚胎干细胞自我更新与诱导分化

李向东1，王秀丽2

(1.大连医科大学附属第二医院 心血管内科，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学 基础医学院 组织胚胎学教研室，辽宁 大连 116044)

本文在简述胚胎干细胞生物学性状的基础上，重点综述胚胎干细胞自我更新和诱导分化研究的相关进展，其中包括由外源性细胞因子(LIF因子)和内源性转录因子(Oct-4, Nanog)共同参与的自我更新调控机制；通过条件培养基和基因转染的方法定向诱导干细胞分化以及微环境对干细胞诱导分化的影响及调控，最后提出干细胞研究面临的挑战。可为今后干细胞的基础科研及应用开发提供必要的理论依据和技术指导。

胚胎干细胞；拟胚体；自我更新；分化；微环境；组织工程

生命科学是20世纪末和21世纪初自然科学中发展得最为迅猛的学科。干细胞的研究与应用则成为其中最令人瞩目的领域之一。近年来，伴随生物学实验技术的日益成熟，加之相关学科的理想结合与渗透，使得胚胎干细胞、成体干细胞以及诱导性多能干细胞的研究持续取得突破性进展，同时其应用领域也得以不断拓宽和深入，显示出广阔的应用前景。有关干细胞的定义、分类以及生物学特性的综述已有诸多报道，本文将在简述胚胎干细胞生物学性状的基础上，重点综述胚胎干细胞的研究现状，并提出该研究领域所面临的挑战，以期对今后干细胞的基础科研及应用开发提供一定的理论指导。

1 干细胞的生物学性状

干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内，在特定的条件下具有一定的自我更新与增殖分化能力的一类细胞[1]。这些细胞不但能够产生表现型与基因型与自身完全相同的子细胞，而且能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞 (图1)。

图1 干细胞分裂示意图Fig 1 The Schematic diagram of stem cell’s dividing pattern

依干细胞的发生学来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和成体干细胞(adult stem cell, ASC)两大类。与ASC比较，ESC具有独特的生物学特征：(1)发育的全能性，在一定条件下具有向内、中、外三胚层细胞分化的能力，在理论上可以诱导分化为机体内所有类型的细胞；(2)种系传递能力，能够形成嵌合体动物；(3)易于进行基因修饰，ESC技术和基因打靶技术相结合，如基因敲除(gene knock-out)和基因转染(transfection)已成为研究基因功能的重要手段。

正是基于ESC自身所特有的发育全能性，决定了干细胞生物学与干细胞组织工程学的研究方兴未艾，并且在发育生物学模型、细胞替代治疗和基因治疗的载体以及药物研发等领域具有重要的应用潜能[2]。

2 胚胎干细胞研究现状

在干细胞的研究与应用中，ESC一直是引人关注的热点[3-4]。但若要真正实现ESC的应用价值，明确其自我更新及多向分化的调控机制、实现其高效定向分化才是问题的关键。故这里重点针对上述两个方面的问题对ESC的研究现状加以综述。

2.1 ESC自我更新的研究

ESC的自我更新是一个极其复杂的调控过程，其中包括外源性细胞因子和内源性转录因子的共同参与。

2.1.1 细胞因子刺激的自我更新：用仅添加血清的培养基进行单一培养，既不能获得ESC，也不能维持ESC的生长。但通过与滋养层细胞共培养或使用添加有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)的培养基便可以维持ESC的自我更新。现已明确LIF的基因结构，蛋白表达以及其发挥生物学作用的具体分子途径[5]。LIF蛋白主要由180个氨基酸组成，分子内部二硫键对于维持LIF分子的结构和生物学活性起重要作用[6]。该蛋白主要是通过与LIF受体(LIF receptor, LIFR)相结合促进LIFR发生二聚体化后，并经由以下信号传导途径调节细胞增殖[7]：(1)JAK激酶介导下转录子STAT3发生酪氨酸磷酸化后激活的途径；(2)在接头分子SHP2和Gab1的参与下激活Ras-Erk丝裂原活化蛋白激酶级联反应。

此外，在维持ESC多能性的研究中也有学者发现，在与LIF基因缺失的成纤维细胞共培养时，ESC并未完全分化，而仅是表现为碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)阳性集落数目的减少，即ESC仍部分保留有未分化的潜能[8]。由此说明，在ESC实现其自我更新的过程中尚有其他的非LIF途径共同参与，而所谓“非LIF途径”就是指由各种干细胞转录因子所参与的过程。LIF调控ESC实现自我更新的信号传递路径见图2。

图2 LIF调控ESC实现自我更新的信号传递路径Fig 2 The signal pathway of ES cells self-renewing regulated by LIF

2.1.2 干细胞转录因子协同维持自我更新：Oct-3/4是目前被公认的与ESC多向分化潜能相关的重要转录因子之一。Oct-3/4属于POU(Pit-Oct-Une)家族，通过结合位于启动子活增强子区域8碱基位点ATGCAAAT来调控靶基因的表达，与胚胎发育中的多向分化潜能密切相关[9]。小鼠胚胎表达Oct-4始于4～8细胞期的细胞核部位，且在整个桑椹胚期均可检测到。至囊胚(胚泡)期，Oct-4蛋白集中高水平表达于ICM，而在滋养外胚层却迅速下降。Oct-4在维持干细胞潜能中所扮演的角色是通过对内源基因进行靶向干扰而加以明确的。该因子不但参与多潜能细胞的最初形成，而且还在维持着干细胞自我更新的状态[10]。

与Oct-4比较，Nanog代表了一个不同的同源结构域蛋白。Nanog的表达先是在桑椹胚期；而高水平的Nanog mRNA则持续存在于囊胚早期[11-12]。有趣的是，在胚胎植入前Nanog的表达却开始下降。这个动态的表达谱表明：在胚胎发育的过程中若避免多潜能ESC的非控性增殖，Nanog的下调是至关重要的。为了证实Nanog是不依赖于细胞因子(LIF)而参与维持ESC的自我更新，研究者将Nanog基因整合至ESC，在LIFR拮抗剂的情况下，该修饰细胞在体外传代2次以后，仍保留有自我更新的能力。而未经处理的对照组则完全分化。接下来切除修饰细胞Nanog基因，则对LIF的依赖性再度恢复。而将这些Nanog表达细胞进行胚泡注射时，发现这些供体细胞能够参与嵌合体内各组织器官的发育形成。上述工作有力证明了在ESC实现自我更新的非LIF依赖性的调控途径中，Nanog 分子是不可忽视的[13]。

有关Oct-4与Nanog之间的相互关系，迄今尚未形成较为全面的认识。但有研究表明，Oct-4表达可能利于Nanog蛋白的动态表达及定量调节，即二者之间可能存在一定的协同作用，从而促进ESC实现自我更新[14]。

2.1.3 其它外源性因子调控ESC自我更新：已经证明在ESC体外传代培养的过程中，若添加BMP4、BMP2、GDF6替代血清成分，ESC仍可以进行自我更新。但BMP/GDF发挥其作用必须依赖于LIF的激活[15-16]。在单独含有BMP的条件下，ESC将向非神经细胞方向分化。但若与LIF联合作用，即便是滋缺失养层细胞和血清组分的情况下也能够维持ESC的自我更新。BMP这种抑制分化的效应似乎是与其诱导Id家族成员的表达有关。Id成员均为负性转录调控修饰因子，能够参与ESC分化抑制的调节，也成为BMP/GDP信号参与ESC自我更新的关键路径。此外，也有相关证据表明，Wnt通路能够短期维持小鼠和人ESC的多向分化潜能[17-18]。但尚未明确Wnt信号的特异性激活是否将有利于ESC多向分化潜能的维持，而在多次克隆传代培养过程中，上述效应是否依然发生。

综上，ESC的自我更新是多因素、多环节、多径路所共同调节的过程。但目前我们所认知的部分还很有限，只有在信号传导方面开展更多的工作才有可能揭示ESC自我更新的奥秘，才能为ESC诱导分化的研究提供相应的理论基础，促进高效、定向分化的实现。

2.2 干细胞分化的研究

除上述对ESC自我更新的调控的研究，干细胞领域内另一个备受关注的热点便是干细胞的分化。 目前对干细胞发育调控的研究不断深入，已有越来越多类型的分化细胞被诱导、鉴定出来。以下分别从ESC定向分化及调控的进展方面加以介绍。

2.2.1 ESC定向诱导分化的研究：“拟胚体(embryoid bodies, EBs)形成法”是目前研究ESC体外分化的常规方法(图3)。但该方法只能产生含有多种分化的组织细胞的混合体，而不能形成单一的细胞克隆。为了获取一定数量的ES源细胞，基于前期的研究基础，人们开始尝试其他可以实现ES细胞定向分化的诱导途径。

图3 悬滴法制备拟胚体示意图Fig 3 Forming of embryoid bodies (EBs) with hanging drops method

(1)通过设置培养条件，添加条件培养基，实现定向的细胞分化。有人将小鼠ESC置于含碱性成纤维生长因子(FGF-2)的培养基中增殖，后加入血小板生长因子(PDGF)，在二者的混合培养基内，得到了表达神经胶质前体标志分子的多能祖细胞。当去除FGF-2和PDGF后，这些细胞最终只向着少突神经胶质或星形胶质细胞分化。Vogel G[19]将人ESC培养至EBs后，分离出部分分化的EBs在bFGF的培养基内培养，最终获得96%表达神经元标志的细胞。此外，若将ESC置于TISFn的条件培养基内进行阶段培养，然后在含多种生长因子的N2无血清培养基内诱导即可获得表达insulin和其他胰腺内分泌激素的类胰岛细胞[20]。以上均证明，条件培养基在ESC的定向诱导中占有不可或缺的重要地位。

(2)利用特定细胞表面标志或加入系列特异性的标志基因，通过荧光激活的细胞分选法(fluorescent activated cell screening, FACS)或筛选性培养基选出特定类型的细胞，进行再培养，产生特定的分化细胞[21-22]。

通常对造血前体细胞的筛选都是通过FACS进行的，因为相对于其他类型的前体细胞，该细胞的表面标志比较明确，均可商品化购买，最终获得的细胞纯度可以达到99%。而对基因修饰后ESC进行筛选分化的操作则多集中在心肌细胞的研究领域，这可能要归结为心肌诱导分化方面的相关研究开展得最早，进展得也最为深入[23]。研究者通过构建具有α-MHC或MLC-2v启动子的筛选质粒，经诱导分化、筛选可获得高纯度的、可表达MHC，α-肌动蛋白(α-actin)及中等纤维结蛋白(desmin)等特征蛋白的ES源心肌细胞[24-25]。上述研究为获取一定数量的靶细胞提供了理想的实验手段，也使得ESC源细胞的临床应用渐趋于现实可行。

ESC所特有的生物学潜能决定了其在干细胞研究中的主导地位。但这并非意味着ESC可以涵盖甚至是替代ASC在细胞治疗中所发挥的作用。近年来在干细胞替代治疗中，ASC以及诱导性多能干细胞以其来源广泛、类型多样以及非免疫原性等优势已经备受研究者的关注，显示出前所未被认知的应用潜能，但在这里不加赘述。

2.2.2 胚胎干细胞分化的调控：ESC本身所具有的分化潜能的多样性，反映了干细胞分化发育调控的复杂性。目前对其调控机制的研究还非常有限，可分为内源性和外源性调控两个方面，二者相辅相成，不可分割。其中，内源性调控主要涉及干细胞内的结构蛋白、结构因子、转录因子等，可影响干细胞非对称性有丝分裂及细胞因子的分泌等，从而实现对干细胞分化发育的调控[26-27]。有关干细胞分化的外源性调控，近年来也越来越受到关注。所有参与调控的外源性因素共同组成了干细胞的微环境。2000年，Watt和Hogan[28]联合在《Science》发表《走出伊甸园：干细胞与微环境》的文章，首次强调了微环境在干细胞分化调控所发挥的重要作用。对此本综述将做重点阐述。

微环境(microenvironment)，或者称为“壁龛(niche)”概念的首次提出是基于造血干细胞(HSC)分化的研究中[29]，但现在已经外延至包括所有控制干细胞命运—自我更新、分化或凋亡的外源性信号，可能存在于干细胞之间，干细胞与基质间，以及干细胞与远端非直接接触的理化因素之间[30]。目前研究者将其分为以下几个方面：

(1)分泌因子。大量的分泌因子参与了干细胞命运的调控过程，其中具有代表性的是：TGFβs和Wnts家族[31]。TGFβ信号蛋白家族成员能够促进神经嵴干细胞的分化发育；在那些通过非对称性分裂来实现其自我更新的组织中，Wnts能够通过α-catenin路径来激活干细胞转录以促进组织更新。此外，在卵裂球的非对称性分类中Wnt信号则能够控制纺锤体的定向性，并促进内胚层的发育。

(2)膜蛋白介导的细胞间作用。除了分泌因子，细胞彼此间的直接接触也是微环境中调控干细胞命运的重要因素[32]。细胞间接触的信息主要通过跨膜蛋白分子进行传递，如在果蝇体内，膜蛋白受体Notch及其配体Delta在Numb蛋白的参与下共同影响神经干细胞的分裂，过程中Notch的活性受到抑制，从而使由Notch介导的细胞间相互作用产生偏向性，最终导致非对称性分裂的发生。需指出的是，虽然β-catenin是细胞粘附连接的结构成分，但目前对其在干细胞的调控中的具体作用却无相应报道。

(3)整合素和细胞外基质。细胞外基质成分的改变会影响干细胞的分化。其中研究得较为广泛的就是整合素(integrins)[33]。整合素能维持干细胞存在于组织内的相应位置，若其表达丧失就会导致干细胞选择分化或凋亡途径以脱离干细胞的微环境。整合素也可以发挥传递信号的作用，当干细胞的微环境发生改变如受到损伤时，胞外某些信息可通过整合素α5β1，αvβ5，及αvβ6等传递给干细胞，以触发跨膜信号转导，调控细胞的基因表达。这一过程不仅可以改变干细胞的分裂方式，而且还能够激活干细胞的多潜能性，使干细胞产生一种或多种定向祖细胞，以适应组织修复的需要。另外，这些胞外基质还能隔绝和调节那些存在于干细胞微环境内的分泌因子的局部浓度，间接调控干细胞的分化发育[33]。

综上，微环境因素在调控干细胞的命运方面的确担当着非常重要的角色，不仅维持着干细胞的自我更新，而且也在控制着干细胞的分化定向。当然其功能的发挥并不脱离于干细胞的内源性调控因素，而是通过直接或间接的激化内源性途径来实现的。

近年来伴随组织工程与再生医学新技术的不断发展，三维培养(three dimensional culture, 3D culture)技术因其在体外模拟构建复杂微环境方面的独特优势也被逐渐应用至干细胞的诱导分化研究领域。 本团队在前期工作中就曾先后成功建立基于APA微胶囊和胶原3D水凝胶的ESC培养体系，前者能够影响ESC的增殖分化的调控[34]，后者则能够高效诱导ESC定向分化为具有理想表型和功能的类胰岛素分泌细胞[35]。其中，对比平面诱导体系，经胶原3D培养诱导体系所获得的靶细胞对高糖水平的应答能力显著提高。此外，新近基于3D生物材料支架体系定向诱导ESC分化为不同胚层来源的神经细胞、心肌细胞、肝细胞等研究也均有成功报道[36]。这些均为“微环境调控ESC命运”这一论点提供了有力论据。微环境不但提供了大量的信号分子，而且也调控者干细胞本身对分化信号分子的选择性应答，由此使干细胞内源调控基因的再程序化，最终实现高效定向诱导分化[37]。

3 干细胞研究面临的挑战

虽然干细胞在基础科学与临床应用研究中都显示出理想的应用前景，但必须明确的是，干细胞作为一个崭新的应用元素，仍存在着一些不可回避的问题[38]。

首先，如何维持干细胞体外扩增时不发生分化？ESC和ASC在体内外均具有自我分化的潜能，极易分化为其它细胞。虽然体外抑制干细胞分化方面已取得重大进展，但对其培养条件仍需优化，以在扩增中最大限度的维持干细胞多向分化的潜能。

其次，如何定向诱导干细胞分化？干细胞研究的主要瓶颈问题之一就是要阐明ESC发育的调控机制，实现其定向诱导分化。另外，若使ESC真正应用于细胞替代治疗，还需解决移植细胞的发育类型及其数量的问题。如在肝细胞替代治疗中，可以分离并移植那些相对发育成熟且仍保留有一定的增殖和再生潜能的细胞[39]；而对血液系统的持续性替代治疗则要求移植相对幼稚的造血干细胞[40]。那么究竟如何选取特定发育阶段的细胞进行移植——这当然也很大程度上取决于人们对干细胞定向诱导分化的认知。遗憾的是，人类在该方面的知识积累还很欠缺，获得一定量靶细胞的最优化条件尚待建立。

最后，干细胞的分离纯化技术尚不够完善。ESC分化的体系决定了其分化产物的混杂性。 但受限于前体细胞标识的非确定性，很难对目的细胞进行高效的分离与纯化，这不但减低了移植细胞的数量，而且也存在致瘤的危险[41-42]。此外，干细胞治疗中供/受体的免疫排斥的问题也不容忽视[43]。建立各种HLA表型的ESC库、对ESC进行基因修饰以降低其免疫原性可能是解决免疫排斥问题的理想方案[44-45]。更重要的是，近年来有关诱导性多能干细胞和细胞重编程的突破性研究也可能为干细胞的转化研究提供新的技术策略。 以上对ESC研究中所面临的问题做出了系统的陈述，但就本质而言，贯穿所有问题的核心只有两个，即是阐明干细胞维持自我更新、谱系发育的机制；实现干细胞定向分化。而事实上，这也正是当前干细胞研究所围绕的关键核心。相信伴随生命科学技术的日趋完善与成熟，研究者会逐渐揭开“干细胞”的神秘面纱，铺设干细胞转化应用的桥梁，从而最终真正将干细胞成功应用于的临床。

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Self-renewalanddifferentiationofembryonicstemcells

LI Xiangdong1, WANG Xiuli2

(1.DepartmentofCardiovascularDiseases，theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027，China; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,CollegeofBasicMedicalSciences,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

This review will briefly introduce the biological characteristics of embryonic stem cells (ESCs) followed by the focuses on the mechanisms of self-renewing and the strategies of lineage-specified differentiation of ESCs in recent years. In particular, mechanisms of regulating the self-renewing of ESCs including the participation of both cytokine and transcriptional were discussed. Conditioned medium and gene transfection were also reviewed for the induced differentiation of ESCs in vitro. Most importantly, the indispensable role played by the stem cell microenvironment in regulating the fate of ESCs and the challenges that being faced by the stem cell-based therapy have also been discussed in this mini-review. It is expected that it would not only enlighten the basic research of stem cells but also promote its transformed application in clinical therapy.

embryonic stem cells (ESCs)；embryoid bodies (EBs)；self-renewing；differentiation；microenvironment；tissue engineering

R318

A

1671-7295(2017)05-0417-06

李向东，王秀丽.胚胎干细胞自我更新与诱导分化[J].大连医科大学学报，2017,39(5)：417-422，432.

2017-08-19；

2017-10-05)