三阴性乳腺癌患者miR-155的表达及在新辅助化疗中的意义

谢小红 许雷来 顾锡冬

三阴性乳腺癌患者miR-155的表达及在新辅助化疗中的意义

谢小红 许雷来 顾锡冬

目的分析三阴性乳腺癌患者miR-155的表达及在新辅助化疗中的意义。方法 选取采用表柔比星+环磷酰胺方案新辅助化疗4个周期并成功实施乳腺癌改良根治术的女性三阴性乳腺癌患者23例，收集其在新辅助化疗前后的肿瘤组织标本和临床基本资料，采用RT-PCR法检测患者新辅助化疗前后癌组织的miR-155表达水平，并分析其在不同临床病理学特征患者中的表达情况。结果 新辅助化疗后miR-155表达水平较化疗前明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。Ki-67高表达的三阴性乳腺癌患者miR-155的表达水平显著高于Ki-67低表达的患者，差异有统计学意义（P＜0.05），而在不同年龄、原发灶分期、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况患者之间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论 miR-155可作为判断三阴性乳腺癌新辅助化疗疗效及预后的肿瘤分子标志物，临床上miR-155、Ki-67高表达的三阴性乳腺癌患者可能从新辅助化疗中得到更多获益。

三阴性乳腺癌 miR-155 Ki-67 临床病理学特征

目前乳腺恶性肿瘤占世界妇女恶性肿瘤的第一位，全世界每年约有超过100万妇女被查出患有乳腺癌，占所有妇女新发恶性肿瘤的29%[1-2]。临床上常用免疫组化技术检测乳腺癌组织中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、原癌基因人类表皮生长因子受体2（HER-2）、增殖指数（Ki-67）的表达状况，以此将乳腺癌分成5个亚型。其中三阴性乳腺癌为ER、PR、HER-2均为阴性的乳腺癌，因其无法进行内分泌及靶向治疗，化疗不敏感且易复发、预后差而成为临床上研究的热点之一[3]。miRNA是近几年才被发现的一类小分子短链非编码RNA，它的表达可能调控着肿瘤发生、发展及变异。除此之外，miRNA作为细胞调控的一员，调控着细胞及个体的各项生命活动，包括细胞增殖与分化、细胞凋亡、个体的发育及器官的形成等[4-6]。本课题组前期的研究发现miR-155在体外实验及肿瘤组织中表达明显上调[2]，而有关miR-155与三阴性乳腺癌新辅助化疗的关系的报道目前较少。本研究旨在探索miR-155在新辅助化疗前后三阴性乳腺癌组织中的表达情况及其在不同乳腺癌临床病理学特征患者中的表达情况，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年6至12月采用表柔比星+环磷酰胺（EC）方案新辅助化疗4个周期并成功实施乳腺癌改良根治术的女性三阴性乳腺癌患者23例，年龄36～61岁，中位年龄49岁；所有入组患者均为首次确诊乳腺癌，且符合本课题组临床入组标准。入组标准：（1）女性，年龄18～70岁；（2）临床高度疑似乳腺癌的患者，经空心针穿刺活检病理学上确诊为原发浸润乳腺腺癌，且免疫组化结果ER、PR、Her-2均为阴性；（3）患者至少具有1个及以上可测量的肿瘤病灶，并按照《美国AJCC癌症分期手册》进行临床TNM分期；（4）患者符合新辅助化疗指征[7]；（5）先前未接受过放化疗等针对乳腺癌的治疗；（6）心、肺、肝、肾功能正常，生命体征无异常。排除标准：（1）不愿意接受化疗或拒绝完成既定化疗周期的；（2）哺乳期或孕期乳腺癌；（3）心、肺、肝、肾功能异常；（4）除乳腺癌之外具有其他肿瘤病史的。本研究经医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2 新辅助化疗方案 本组患者均选择EC方案，即每周期表柔比星75mg/m2，环磷酰胺600mg/m2，21d为1个周期，共4个周期。本组患者均在完成4个EC周期化疗、评估疗效后实施乳腺癌改良根治术。

1.3 新辅助化疗前后评估指标 入组患者术前按照实体瘤的疗效评价标准进行临床疗效评估，并收集入组患者住院期间的临床资料，包括年龄、原发灶分期、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况、Ki-67表达水平（Ki-67≥14% 为高表达，Ki-67＜14%为低表达）。

1.4 标本收集 收集23例乳腺癌患者新辅助化疗前后的组织标本共46例。新辅助化疗前标本为采用8G麦默通穿刺活检获取的新鲜乳腺癌组织标本，置于EP冻存管中，液氮速冻之后转移至-80℃冰箱保存。新辅助化疗后标本为术中取新鲜乳腺癌组织标本，置于EP冻存管中，液氮速冻之后转移至-80℃冰箱保存。所有标本的HE染色及免疫组织化学EnVison染色均由本院病理科检测。

1.5 主要试剂和仪器

1.5.1 主要仪器 电子分析天平（FA2004N型，上海沪粤明科学仪器有限公司）；Millipore Direct-Q5超纯水系统（美国密理博公司）；冷冻离心机（Multifuge 3R plus，美国赛默飞世尔公司）；-80℃超低温冰箱（Ultra Freeze 3410，美国赛默飞世尔公司）；TOMY SX-500高压灭菌锅（日本SeikoCo公司）；微量移液器（美国吉尔森公司）；PCR仪（型号9700，美国ABI公司）；LightCycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪（美国罗氏公司）；NanoDrop 2000分光光度计（美国赛默飞世尔公司）。

1.5.2 主要试剂 mirVanaTMRNA Isolation Kit试剂盒（批号：AM1561，美国赛默飞世尔公司）；miScriptⅡReverse Transcription Ki（t批号：218161，德国凯杰公司）；QuantiFast®SYBR®Green PCR Ki（t批号：204054，德国凯杰公司）；Universal prime（r德国凯杰公司）；microRNA-specific prime（r上海捷瑞公司）；0.2ml PCR管（批号：PCR-02-C，美国爱思进公司）；384孔板（批号：04729749001，美国罗氏公司）；10μl、200μl、1ml tip（s美国爱思进公司）。

1.6 miR-155表达水平检测 采用RT-PCR法，miR-155及内参5S的引物序列见表1。取-80℃冰箱保存的冷冻乳腺癌组织0.1g，在液氮中研磨匀浆，将组织悬液按照mirVanaTMRNA Isolation Kit试剂盒的操作说明提取总RNA，然后采用NanoDrop 2000分光光度计评估提取RNA的浓度和纯度。利用miScriptⅡReverse Transcription Kit将待测RNA逆转录成cDNA。逆转录体系：总 RNA，0.5μg；5×miScript HiSpec Buffer，2μl；10×Nucleics Mix，1μl；miScript Reverse Transcriptase Mix，0.5μl；Nuclease-free H2O加至10μl。反应条件为37℃ 60min，95℃ 5min。逆转录完毕后加入90μl Nuclease-free H2O储存在-20℃冰箱备用。利用QuantiFast®SYBR®Green PCR Kit试剂盒在LightCycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪上进行反应。体系：2×QuantiFast®SYBR®Green PCR Master Mix，5μl；10μM Universal primer，0.2μl；10μM microRNA-specific primer，0.2μl；cDNA，1μl；Nuclease-free H2O，3.6μl。PCR 反应条件为 95℃5min，95℃ 10s，60℃ 30s，40 个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每摄氏度采集5次荧光信号。实验重复3次。miR-155表达水平计算方法：以 5S 作为内参，采用 2-ΔΔCt法：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt= ΔCt实验组样品-ΔCt对照组样品，相对表达量=2-ΔΔCt。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，新辅助化疗前后miR-155表达水平比较采用配对t检验，不同临床病理特征患者miR-155表达水平比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 miR-155及内参5S的引物序列

2 结果

2.1 新辅助化疗前后三阴性乳腺癌组织中miR-155表达情况 新辅助化疗前miR-155相对表达量为0.036±0.048，化疗后相对表达量为0.010±0.014，新辅助化疗后miR-155表达水平较化疗前明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 1。

图1 新辅助化疗前后三阴性乳腺癌组织中miR-155表达情况

2.2 不同临床病理特征三阴性乳腺癌患者miR-155表达水平比较 Ki-67高表达的三阴性乳腺癌患者miR-155的表达水平显著高于Ki-67低表达的患者，差异有统计学意义（P＜0.05），而在不同年龄、原发灶分期、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况患者之间比较差异均无统计学意义(均P＞0.05)，见表2。

表2 不同临床病理特征三阴性乳腺癌患者miR-155表达水平比较

3 讨论

三阴性乳腺癌是ER、PR、HER-2均阴性表达的乳腺癌亚型，其占所有乳腺癌亚型的15%～20%[8]。由于其免疫组化的特点注定该种亚型不适合接受内分泌治疗和分子靶向治疗，因此，化疗就成为治疗三阴性乳腺癌的唯一手段。随着对新辅助化疗研究的越来越深入，其临床应用也越来越广泛，新辅助化疗己成为三阴性乳腺癌个体化治疗中一个新的治疗手段，并取得较好的疗效[9]。三阴性乳腺癌患者达到病理完全缓解（pCR）意味着更长的生存获益，未达pCR的患者往往预后较差，肿瘤和淋巴结的残留导致这部分患者和其他亚型乳腺癌患者相比具有更高的复发率以及更差的生存期[10]。因此，寻找一种新辅助化疗疗效相关的肿瘤标志物迫在眉睫，该肿瘤标志物可用于指导三阴性乳腺癌的诊断、治疗和判断预后。

一项关于三阴性乳腺癌的大规模研究显示与正常乳腺组织相比，三阴性乳腺癌组织中共有116个miRNA表达失调，其中miR-155表达上调[11]，可见miR-155与三阴性乳腺癌的发生、发展存在一定的关系。本课题组前期研究也发现，与乳腺增生组织比较，miR-155在三阴性乳腺癌组织中表达也明显上调[12]。miRNAs主要分为两大类：一类是具有促癌功能的miRNA，另一类是具有抑癌功能的miRNA。黄选东等[13]研究显示miR-155可归为癌基因这一类，并且参与细胞的多种生理病理过程。miR-155的功能主要包括调控肿瘤的发生、发展、炎症的产生以及对免疫的调节，其表达上调在诸多不同种类的肿瘤中被验证[14-15]。本研究发现miR-155在新辅助化疗后表达明显下调，说明miR-155有可能作为预测新辅助化疗疗效的肿瘤标志物。另外，本研究也探讨了不同临床病理特征三阴性乳腺癌患者miR-155表达水平，发现Ki-67高表达的三阴性乳腺癌患者miR-155的表达水平显著高于Ki-67低表达的患者，差异有统计学意义；但其在不同年龄、原发灶分期、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况患者之间比较差异均无统计学意义。由此提示miR-155的表达与Ki-67的表达有一致性，与预后相关，这与邵营波等[16]的研究类似。

综上所述，本研究初步探索了miR-155与三阴性乳腺癌新辅助化疗的关系，结果提示miR-155作为预测三阴性乳腺癌新辅助化疗疗效存在一定的可能性，并且miR-155的表达在不同Ki-67的表达状态下具有统计学差异，提示临床上miR-155、Ki-67高表达的三阴性乳腺癌患者，可能从新辅助化疗中得到更多的获益。但本研究入组的三阴性乳腺癌患者过少，仍存在一定的局限性，相信在本研究初步探索的基础上，增大样本量，能为miR-155在三阴性乳腺癌新辅助化疗方面的运用提供更加有力的实验支持。

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《浙江医学》对图表的要求

稿件中若有图表，分别按其在正文中出现的先后次序连续编码。每幅图应冠有图题。说明性的文字应置于图下方注释中，并在注释中标明图表中使用的全部非公知公用的缩写。线条图应墨绘在白纸上，高宽比例以5∶7为宜。以计算机制图者应提供激光打印图样。照片图要求有良好的清晰度和对比度；图中需标注的符号（包括箭头）请用另纸标上，不要直接写在照片上。每幅图的背面应贴上标签，注明图号、方向及作者姓名。若刊用人像，应征得本人的书面同意，或遮盖其能被辨认出系何人的部分。大体标本照片在图内应有尺度标记。病理照片要求注明染色方法和放大倍数。图表中如有引自他刊者，应注明出处。电子版投稿中图片建议采用JPG格式。表格建议采用三横线表（顶线、表头线、底线），如遇有合计和统计学处理内容（如t值、P值等），则在此行上面加一条分界横线；表内数据要求同一指标有效位数一致，一般按标准差的1/3确定有效位数。

本刊编辑部

Expression of miR-155 in triple-negative breast cancer and its significance in neoadjuvant chemotherapy

XIE Xiaohong,XU Leilai,GU Xidong.Department of Breast Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China

ObjectiveTo investigate the expression of miR-155 in triple-negative breast cancer and its significance in neoadjuvant chemotherapy. Methods Twenty-three patients with triple-negative breast cancer,who

4 cycles of neoadjuvant chemotherapy with epirubicin+cyclophosphamide regimen and successfully underwent radical mastectomy,were enrolled in the study.The tumor specimens and clinical data were collected before and after neoadjuvant chemotherapy.The expression of miR-155 in cancer tissue was detected by RT-PCR technique and the result was compared before and after neoadjuvant chemotherapy.The correlation of miR-155 expression with clinical and pathological features of patients was analyzed. Results The expression of miR-155 after neoadjuvant chemotherapy was significantly lower than that before neoadjuvant chemotherapy(P＜0.05).The expression of miR-155 in patients with Ki-67 overexpressing was significantly higher than that in those with Ki-67 low expression(P＜0.05).There was no significant difference in the expression of miR-155 among patients with different age,histological grade,clinical stage and lymph node metastasis status(all P＞0.05). Conclusion The expression of miR-155 can be used as a molecular marker for the efficacy of neoadjuvant chemotherapy and the prognosis of patientswith triple-negative breast cancer.Clinically,triple-negative breast cancer patientswith miR-155 and Ki-67 over-expression may benefit from neoadjuvant chemotherapy.

Triple-negative breast cancer miR-155 Ki-67 Clinico-pathological conference

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-924

浙江省医药卫生科技计划项目（2015KYB267）

310006 杭州，浙江中医药大学附属第一医院乳腺外科

谢小红，E-mail：xxh666857@163.com

2017-04-22）

（本文编辑：陈丽）