细菌群体感应淬灭酶及其病害防治研究进展

范兴辉 王惠杉 何杰华 叶田 阳芳 陈少华

（华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室 群体微生物研究中心，广州 510642）

细菌群体感应淬灭酶及其病害防治研究进展

范兴辉 王惠杉 何杰华 叶田 阳芳 陈少华

（华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室 群体微生物研究中心，广州 510642）

微生物细胞间通过信号分子进行信息交流的现象即群体感应（Quorum sensing，QS），QS广泛存在于微生物群体中，且可以调控特定基因尤其是很多致病基因的表达。群体感应淬灭（Quorum quenching，QQ）是基于群体感应现象提出的新型病害防治策略，即通过抑制信号分子的合成、监测或对信号分子进行酶降解、修饰的途径来干扰群体感应以达到防治病害的目的。利用群体感应淬灭酶（Quorum quenching enzymes）降解微生物信号分子，是目前毒性最小、最为有效的群体感应淬灭途径。迄今为止，多种细菌信号分子的群体感应淬灭酶都已有报道，其中，酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs）和顺-11-甲基-2-癸烯酸（cis-11-Methyl-2-dodecenoic acid）群体感应淬灭酶研究最为深入。综述并分析了群体感应淬灭酶及其病害防治的研究现状、存在的问题和未来研究方向，为今后发展新型绿色安全病害防控措施提供关键理论和技术支撑。

群体感应；群体感应淬灭酶；酰基高丝氨酸内酯；顺-11-甲基-2-癸烯酸

介导微生物群体感应的化学信号分子主要分为3类：（1）在革兰氏阴性细菌中，信号分子多为脂肪酸类的衍生物，如酰基高丝氨酸内酯类物质（N-acyl homoserine lactones，AHLs）、被简称为DSF的顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸（cis-11-Methyl-2-dodecenoic acid）等，其中，AHLs类物质的研究最为广泛且深入。（2）革兰氏阳性菌的信号分子多为寡肽（Auto inducing peptide，AIP）。（3）除了以上几种信号分子，介导微生物QS 调节的信号分子还包括自诱导剂AI-2、2-庚基-3-羟基-4（1H）-喹诺酮（PQS）、3-羟基-棕榈酸甲酯（3-OH-PAME）、二烷基间苯二酚（DARs）［5］、α-吡喃酮［6］等。

通过抑制信号分子的合成、积累、监测，或对信号分子进行酶降解或修饰的机制来干扰群体感应系统，即群体感应淬灭（Quorum quenching，QQ）。群体感应淬灭不仅可以通过相应的降解酶来实现，也可以通过物理条件的改变来实现。研究发现，AHLs在碱性条件下会出现高丝氨酸内酯环结构被破坏的现象，失去QS信号分子活性，且随着pH值的增大和AHLs酰基侧链长度的减少，破坏程度加深［7］。能够降解信号分子，使其浓度低于临界值，抑制病原菌相关毒力因子表达的酶，即群体感应淬灭酶（Quorum quenching enzymes）。在不同生物体包括细菌、酵母菌和真核生物中均已发现群体感应淬灭酶。在肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）中发现的AHLs降解酶AhlK，能够将高丝氨酸内酯的内酯键打开，使其失去信号分子活性［8］。邱健等［9］首次筛选到一株具有降解AHLs活性的酵母菌，经鉴定为红冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides），此菌产生的降解酶对短中长链AHLs均具有较好的降解效果，即该酶底物谱较为广泛，经鉴定此酶为AHLs内酯酶［10］。但是，关于编码此酶的基因，尚未有详细报道。Bar-Rogovsky等［11］报道，广泛存在于哺乳动物组织中的对氧磷酶（PONs）能有效水解AHLs。迄今为止，已报道的信号分子降解酶大多是在细菌中发现。本文重点阐述了微生物群体感应淬灭酶研究现状，旨为今后发展新型绿色安全病害防控措施提供关键理论和技术支撑。

1 细菌信号分子降解酶的研究

1.1 AHLs淬灭酶

20世纪80年代，首次在革兰氏阴性菌海洋细菌费氏弧菌（Vibrio fischeri）中发现AHLs信号分子［12］，在此之后，多种不同结构的AHLs陆续被发现并报道。作为革兰氏阴性菌的主要信号分子，大多数AHLs具有相同的高丝氨酸内酯环结构且都具有酰基侧链，但其酰基侧链长度、饱和度存在差异。除此之外，还存在几种结构特殊的AHLs，如N-羧化的 AHLs［13］、肉桂酰基—高丝氨酸内酯［14］、支链异戊酰基-高丝氨酸内酯［15］、香豆酰基-高丝氨酸内酯［16］。但是，关于这几类特殊结构AHLs降解酶的研究报道较少。

自2000年首次在芽孢杆菌（Bacillus cereus）分离出AHLs内酯酶［17］，在争论贪噬菌（Variovorax paradoxus）分离出AHLs酰胺酶［18］以来，许多关于AHLs降解酶的报道相继出现。根据AHLs淬灭酶催化机制，将其分为3类：AHLs内酯酶、AHLs酰胺酶和氧化还原酶。已筛选出的AHLs降解酶大多属于AHLs内酯酶和AHLs酰胺酶。

1.1.1 AHLs内酯酶 由aiiA基因编码的AiiA酶，是第一种被发现的群体感应淬灭酶，经鉴定此酶为AHLs内酯酶［17］。除此之外，在其他一些细菌中也发现了AHLs内酯酶。例如，在节杆菌（Arthrobacter sp.）中发现的 AhlD 酶［8］，在土壤芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus）中发现的GKL酶［19］以及近期在动性球菌（Planococcus sp.）中发现的AidP酶［20］等。各内酯酶的系统进化关系，如图1所示。

目前发现的AHLs内酯酶有金属β内酰胺酶、α/β水解酶、对氧磷酶（PONs）、糖基水解酶和酰胺水解酶（图1）。AHLs内酯酶大多属于金属β内酰胺酶，此类酶具有一个高度保守的的Zn2+结合域HXHXDH，Zn2+对内酯酶活性具有决定性作用，但不同内酯酶 Zn2+结合区域有所不同［17］。α/β 水解酶是一类结构上相关，具有多种不同催化功能的酶，这类酶有两个共同特征：一个亲核酸性组氨酸催化三分子和一个序列为Gly-X-Nuc-X-Gly 的亲核基团，这两个区域对AHL 降解活性至关重要［33］。对氧磷酶（PONs）发现于哺乳动物组织中，对氧磷酶家族具有六叶螺旋桨折叠结构及Ca2+催化位点［36］。

图1 AHLs内酯酶系统进化关系图

1.1.2 AHLs酰胺酶 AHLs酰胺酶破坏AHLs酰基链的酰胺键，使高丝氨酸内酯环和酰基侧链分离生成脂肪酸和高丝氨酸内酯。2000年Leadbetter &Greenberg［18］在争论贪噬菌（Variovorax paradoxus）中首次发现AHLs酰胺酶。除了在细菌中发现AHL酰胺酶以外，在放线菌和淡水藻类中也有AHLs酰胺酶的发现，Park等［37］在放线菌链霉菌（Streptomyces sp.）中发现酰胺酶AhlM，Romero等［38］在鱼腥藻属（Anabaena sp.）中发现由基因all3924 编码的酰基转移酶AiiC，这种藻类的细胞原液对长链AHLs具有较好的降解效果。其他AHLs酰胺酶，见表1。

表1 AHLs酰胺酶

目前已经发现的AHLs酰胺酶，绝大部分都属于N末端亲核（Ntn）水解酶。这类酶具有一个保守区域，该区域包含一个α亚单位和一个β 亚单位。β亚单位中熟化和催化作用所需要的N末端亲核在AHLs酰基转移酶中是高度保守的。定点突变显示区域中保守的甘氨酸-丝氨酸对AHLs酰基转移酶活性至关重要［41］。

研究表明，在制药工业中被广泛利用的青霉素V酰基转移酶（PVAs）表现出降解长链AHLs的底物特异性。PVAs属于Ntn水解酶超家族。外源性添加这些酶到铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中大大减少了弹性蛋白酶和绿脓菌素的生产和生物膜形成，并增加了在急性感染的昆虫模型中的存活率［49］。

1.1.3 氧化还原酶 来自芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的细胞色素P450单加氧酶CYP102A1（P450BM-3），能够催化氧化AHLs及其内酯分解产物，AHLs氧化产物仍然具有信号分子活性，但是其活性显着低于母体化合物［50］。在红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）中发现氧化还原酶，其催化3-氧代-C（8-14）-HSLs还原成相应的3-羟基-HSL，从而使信号分子失活，此菌也可以还原化合物N-（3-氧代-6-苯基己酰基）高丝氨酸内酯（含有芳族酰基链取代基）［51］。Chan等［52］从姜根际中分离出的伯克霍尔德杆菌（Burkholderia cepacia）可以将3-氧代-AHL还原成相应的3-羟基化合物。

1.2 DSF淬灭酶

上世纪末，Barber等［53］首次检测到DSF活性，并分析了rpf基因簇（病原致病因子的调控）。DSF信号首先在野油菜黄单胞菌中（Xanthomonas.campestris pv. campestris）得到鉴定，信号分子是顺-11-甲基-2-癸烯酸［54］。迄今为止，许多DSF降解菌被筛选并鉴定，这些降解菌能够降解DSF信号从而影响野油菜黄单胞菌毒力因子的表达。Newman等［55］在芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、微杆菌属（Microbacterium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）细菌中均筛选到能快速降解DSF的菌株，并对这些菌株进行了鉴定。除此之外，Caicedo等［56］在柑橘叶中分离出三株具有DSF降解活性的菌株，分别为Pseudomonas sp. SJ01、Pseudomonas sp. SJ02和Bacillus sp. SJ13。但是，目前还没有文献清楚报道DSF信号的淬灭机制。

1.3 其他信号分子降解酶

其他信号分子有2-庚基-3-羟基-4（1H）-喹诺酮（PQS），自诱导剂AI-2，3-羟基-棕榈酸甲酯（3-OH-PAME）、二烷基间苯二酚（DARs）、α-吡喃酮等。其中二烷基间苯二酚（DARs）和α-吡喃酮为近几年新发现的群体感应信号分子，尚未有关于降解酶的研究报道。

2-庚基 -3-羟基-4（1H）-喹诺酮（PQS）是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）使用的群体感应信号分子。细胞质酶Hod酶能够催化PQS转化为N-辛酰基邻氨基苯甲酸和一氧化碳，将Hod酶添加到铜绿假单胞菌PAO1培养物中，可以降低PQS生物合成基因pqsA的表达［57］。从木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）菌株Q19分离出来的降解酶可以降解PQS，产生新的荧光化合物2-庚基 -2-羟基 -1，2-二氢喹啉 -3，4-二酮（HHQD），Q19也可氧化PQS同源物，产生相应的2-羟基-1，2-二氢喹啉-3，4-二酮，但不能使PQS前体HHQ失活［58］。 红 球 菌（Rhodococcus erythropolis）BG43 能够降解PQS和PQS前体HHQ，进一步研究表明，菌株BG43的环形质粒pRLCBG43有两个基因簇aqdA1B1C1和aqdA2B2C2，预测编码水解酶黄素单加氧酶和双加氧酶［59］。

细菌种间交流信号分子AI-2是衍生自4，5-二羟基 -2，3-戊二酮（4，5-Dihydroxy-2，3-pentanedione，DPD）的一类化合物［60］。研究发现，在体外条件下，大肠杆菌LsrK酶可以磷酸化AI-2［61］。Weiland-Braeuer等［62］通过构建宏基因组文库筛选出QQ-2蛋白，并发现QQ-2蛋白可以通过修改信号分子有效抑制Al-2调节的生物膜形成，QQ-2蛋白可以将Al-2还原为无QS活性的羟基衍生物。

3-羟基-棕榈酸甲酯（3-OH-PAME）是由细菌枯萎病菌（Ralstonia solanacearum）产生的信号分子，调控其毒力因子的表达。Shinohara等［63］在Ideonella sp. 0-0013菌株中发现的β-羟基棕榈酸甲酯水解酶（β-HPMEH）可以降解3-OH-PAME，将3-OH-PAME分解为3-羟基-棕榈酸和甲醇。Achari等［64］在植物体内生菌中筛选出3株对3-OHPAME有降解活性的菌株，分别是嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和类棒菌状红球菌（Rhodococcus corynebacterioides），这些菌株可以使青枯菌的致病力显著下降。

2 结语

抗生素的滥用使得越来越多的致病菌产生抗药性，甚至是多重抗药性。因此，新型的防治策略的提出显得十分重要。群体感应淬灭是基于群体感应机制提出的一种高效的生物防治策略。在病害防治过程中，不直接作用于致病菌，所以不会使致病菌产生抗药性。在多种具有群体感应淬灭作用的群体感应抑制剂中，群体感应淬灭酶是毒性最小、最为安全有效的。群体感应淬灭酶的研究与应用对于农林业、水产养殖业、医药行业的发展具有重要意义。

研究方向展望：（1）AHLs群体感应淬灭酶的研究较为深入，但是要使群体感应淬灭酶广泛应用于农林牧渔业生产及医疗中还存在许多问题要解决，比如淬灭酶的稳定性、催化效率、底物特异性、酶递送和电位问题及是否存在副作用。（2）虽然目前AHLs群体感应淬灭酶研究较为深入，但包括AHLs在内的微生物群体感应信号分子的新型淬灭酶基因的筛选和克隆以及淬灭酶作用机理的研究工作仍需进行。（3）群体感应广泛存在于微生物群体中，但除少数模式细菌群体感应系统有较为全面的研究外，其他重要病害致病细菌、真菌、放线菌的群体感应系统研究并不深入。为此，应该进一步加深对于细菌、真菌、放线菌群体感应系统的研究，如群体感应系统信号通路、群体感应信号的鉴定、群体感应淬灭酶的筛选和应用等，这将为细菌、真菌、放线菌病害提供新的防治策略，同时，有利于发展新型生物防治技术。

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Research Progress on Microbial Quorum Quenching Enzymes and Their Control of Plant Diseases

FAN Xing-hui WANG Hui-shan HE Jie-hua YE Tian YANG Fang CHEN Shao-hua
（State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control，Integrative Microbiology Research Centre，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

The phenomenon of information exchanging through signal molecules between microbial cells is the Quorum Sensing（QS）.QS is widely present in microorganisms，and can modulate the expression of specific genes，especially virulence factors in pathogenic microorganisms. Quorum Quenching（QQ）is a new therapeutic strategy of plant diseases based on QS. QQ can be achieved by interfering QS from inhibiting the synthesis or detection of the signal molecules，or by enzyme-catalyzed degradation or modification of the signal molecules.Degrading signal molecules by using QQ enzymes is one of the most effective and nontoxic ways of QQ. So far，QQ enzymes of various microbial signaling molecules have been reported，especially N-acyl homoserine lactones（AHLs）and cis-11-methyl-2-dodecenoic acid were deeply investigated. In this review，we summarize and analyze the research status，deficiencies and the future development of QQ enzymes and their control of plant diseases，for laying a solid foundation for developing new，green and safe measures of disease control.

quorum sensing；quorum quenching enzymes；N-acyl homoserine lactones；cis-11-methyl-2-dodecenoic acid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0223

微生物通过监测胞外信号分子的浓度来感知群体密度的变化，当其达到某一临界密度值，启动目标基因的表达，协调群体行为，即群体感应（Quorum sensing，QS）。在QS系统中，细菌合成、分泌、监测的物质，即群体感应信号分子，或称为自诱导剂（Auto-inducers，AIs）［1］。20 世纪 80 年代研究发现，海洋细菌费氏弧菌（Vibrio fischeri）可以通过群体感应来调节自身发光现象，这是人们首次发现的群体感应现象［2］。群体感应与许多微生物生物学功能的实现密切相关，包括生物发光、共生现象、生物膜形成、抗生素合成、群体移动性、质粒转移、孢子形成及基因交换等［3-4］。

2017-03-21

国家重点基础研究发展计划（2015CB150600），广东省杰出青年科学基金（2015A030306038），广东省高校青年创新人才项目（2014KQNCX036）

范兴辉，女，硕士研究生，研究方向：微生物群体感应；E-mail：347037188@qq.com

陈少华，男，教授，研究方向：微生物降解、微生物群体感应；E-mail：shchen@scau.edu.cn

（责任编辑 狄艳红）