环境中微生物原位检测方法研究进展

宋伟凤 李明聪 高峥

（山东农业大学生命科学学院 作物生物学国家重点实验室，泰安271000）

环境中微生物原位检测方法研究进展

宋伟凤 李明聪 高峥

（山东农业大学生命科学学院 作物生物学国家重点实验室，泰安271000）

微生物是生态系统物质循环和能量流动的主要参与者，在生态系统中起着重要的作用。但在现有技术条件下可培养微生物所占比例极小，限制了微生物资源的开发利用。目前有许多方法，可以避开微生物不可培养的问题，直接对微生物进行原位检测。对此，将前人关于微生物生态的原位检测研究方法进行了综述，方便以后对这些方法的合理应用。分别从DNA水平、RNA水平和蛋白质水平，介绍了对应的原位微生物检测方法（如BrdU标记、DNA-SIP、FISH和环境转录物组等），比较了它们的优缺点，并介绍了如何将这些方法与目前流行的高通量测序、单细胞测序等技术相结合来捕获原位活性微生物组等。同时，还对这些方法的特点进行了比较，使得人们可以更清楚地了解在不同场景下对不同方法的选择。这些经过改进的新兴方法及其与其它方法的结合使用将有助于解决微生物生态学研究中出现过或即将出现的很多问题。地球上的各种生态系统复杂而庞大，包含的微生物种群也各有差异。各种原位检测方法对微生物生理生态做出了更加真实有效的描述，必将成为研究微生物生态的有力手段。

微生物原位检测；BrdU标记；DNA-SIP；荧光原位杂交；宏基因组；转录物组；生物正交反应

微生物是生物地球化学循环的驱动者，在生态系统中扮演着重要角色［1］。微生物多样性是微生物生态学研究的重要内容，是人们认识、开发和利用微生物资源的前提和基础，对了解微生物与环境互作具有重要意义。早期的微生物多样性研究需要通过纯培养获得菌株后才能对其特性进行描述［2］，可实际上培养得到的只是自然环境中的少部分微生物（0.001%-15%）［3］。随着分子生物学技术的不断发展，直接利用环境样品的总DNA进行16S rRNA基因的PCR扩增并进行鉴定，开辟了将分子生物学技术直接应用于微生物生态学研究的新纪元［4］，解决了环境中未培养微生物研究的难题。然而传统的16S扩增子测序［5］、宏基因组测序［6］和单细胞基因组测序［6］虽然对微生物群落的分布模式及潜在功能鉴定提供了重要依据，却不能对其在环境变化的动态响应进行完全检测［6］。随着研究的深入，越来越多的研究者选择使用原位微生物活性检测与测序组学相结合的方法，对环境中活性微生物的丰度、多样性、群落结构、功能代谢及环境响应能力进行研究［7］。本文综述了现有的常用于微生物检测的一些方法，这些方法可以增加人们对微生物群落成员的不同生态和生理的了解，为人们提供了原位微生物生态群落对环境变化响应的新视角。以下是我们对这一领域中新兴技术前景的探讨。

1 微生物原位检测的常用方法

1.1 基于DNA水平的微生物原位检测方法

DNA 复制是细胞生命周期中的关键环节之一，利用胸苷的类似物进入新合成的 DNA 进行检测一直是研究 DNA 代谢的有效方法［8］。5'-溴脱氧尿苷（BrdU）标记技术是最早开发的可以原位标记活性样品并能结合组学测序的方法。其原理是利用BrdU在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA（和RNA）分子中，随后进行密度梯度离心或者免疫学方法捕获被BrdU标记的DNA/RNA［9］。BrdU标记法已经成功应用于多种环境中微生物分子生态学的研究。目前，研究者们主要针对细菌、古菌和真菌在不同环境刺激下DNA合成活性的变化进行了研究，研究内容包括森林土壤样品中不同碳源刺激下细菌活性的变化［10］，不同植物接种后丛枝菌根真菌后的反应［11］，阿拉斯加北部森林样品中氮添加后微生物活性群落的变化［12］，土壤中活性微生物对不同碳源的反应［9-13］等。虽然BrdU标记实验可以用来检测微生物在各种环境刺激条件下的活性反应，但目前发现的BrdU标记技术与高通量测序结合的应用是十分有限的［14-16］。Hamasaki等［16］通过BrdU标记及454高通量测序对太平洋南北横断面海水样品中活性微生物的物种组成进行了研究，研究结果发现由于环境过滤，微生物群落结构发生了动态变化，活跃的细菌群体更加多样化。然而，由于标记效率较低，需要相对大量的样品，以获取测序所需要的DNA量，这使得这种技术相对昂贵且需要大量劳动力。并且由于不同生物细胞的吸收速率不同，重复性不高，也影响了该技术的普遍应用。

稳定性同位素核酸探针技术（DNA-based stable isotope probing，DNA-SIP），是采用稳定性同位素示踪复杂环境中微生物基因组DNA的分子生态学技术［17］。利用稳定性同位素示踪复杂环境中微生物基因组DNA，实现了由单一微生物生理过程研究向微生物群落生理生态研究的转变，能在更高更复杂的整体水平上定向发掘重要微生物资源，推动微生物生理生态的发展。DNA-SIP分析的原理是通过将同位素稳定的结合到特定的底物上来确定环境中微生物的作用。除磷以外，几乎所有具有生物学意义的元素均有2 种以上的稳定性同位素，而且不同同位素组成的化合物通常具有相同的物理化学及生物学性质，所以微生物可以利用不同的稳定性同位素来进行生长繁殖［17］。Radajewski等［18］将这种方法应用于土壤微生物的甲醇利用的研究，随后确定了有活性的甲基营养型，发现甲基营养型局限于α-变形菌和乳杆菌属，这是这种方法的首次应用。最近，Dumont等［19］从湖泊沉积物的甲烷氧化菌中得到了13CH4标记的RNA宏转录组序列，发现标记的宏转录组序列主要集中于甲基球菌科和甲烷单加氧酶（pmoCAB）基因的转录组序列中。但是，这种方法也受到了许多的限制。例如，孵育时间较长，交互共生问题，容易发生污染，依赖于商用标记化合物，潜在的富集偏向性等。近年来，随着SIP技术的逐渐成熟和不断优化，其应用范围也不断扩展，与其他技术的结合应用也使得DNA-SIP成为重要种群DNA合成序列分析的最好的方法。Huang等［20］将SIP与拉曼光谱和荧光原位杂交技术相结合进行原位杂交，对单个细胞的特性和功能进行了分析。到目前为止，关于DNA-SIP 与宏基因组学结合的研究报道还很少，但从这些研究中可以看出它比传统宏基因组学具有更大的优势，通过运用DNA-SIP 可以提高新酶类发现的概率，也可以减少鸟枪测序法很难解决种群复杂的问题。

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，该技术是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。1980 年，Roumam等［21］首次报道了用荧光素标记的cDNA 进行的原位杂交，自那以后，FISH逐渐成为在环境生物学中最常用的方法之一。作为一种非放射性的检测系统，FISH 技术有其特有的属性和优点：（1）荧光试剂和探针经济、安全；（2）探针稳定，一次标记后可在两年内使用；（3）实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；（4）FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；（5）多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多条序列；（6）既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。尽管如此，这种方法也有缺点：因为细胞内的靶定分子数量较少，探针在细胞内的渗透性差，杂交效率低，所以可以被检测的灵敏度不高。这极大程度的限制了这种方法的应用，所以人们想出了很多方法来克服这个问题。其中催化信使沉积法荧光原位杂交（CARD-FISH）的效果最好。CARD的原理是在过氧化氢存在的前提下，辣根过氧化氢酶（HRP）将其转化成一个酪胺中间体的自由基，这种酪胺可以在细胞或阻断试剂中与芳香族化合物进行非特异性反应，这种反应只发生在HPR附近，而且时间很短，最终HPR分子周围会沉积大量的酪胺，从而获得较强的检测信号［22］。CARD最早是作为放大免疫分析信号的新方法被提出来的［23-24］。1995年，Kerstens等［25］将其应用于荧光原位杂交的信号增强中，取得了良好的效果。Kawakami等［26］通过双通路CARD-FISH技术检测并标记到了mcrA基因；Moraru等［27］使用CARD-FISH和双链DNA探针检测到了海水样品中的泉古菌amoA基因；Kenzaka等［28］将CARD-FISH与纳米金标记的链霉亲和素结合，检测到了质粒上的绿色荧光基因和氨苄青霉素耐药基因。总体来说，荧光原位杂交技术能够将微生物环境中的完整细胞景象的信息进行再现还原，精确度较高，因此在现在的微生物多样性的研究领域中被广泛的应用。

宏基因组也称环境微生物基因组或元基因组，是指环境中全部微小生物（目前主要包括细菌和真菌）DNA的总和。宏基因组学诞生于20世纪90年代，是指不经过微生物培养阶段，直接提取环境中总DNA，对微生物基因总和进行研究的一门学科。1998 年，Handelsman［29］首次提出了宏基因组（Metagenome）概念，认为应该针对环境样品中细菌和真菌的基因组总和进行研究。2006年，Leininger等［30］首次将高通量测序技术应用于土壤中微生物群体的研究发现，古菌在土壤原核氨氧化生物中占优势。2008年，Frias-Lopez等［31］又将该技术应用于对海洋中微生物群落的研究中。随着宏基因组等技术的发展，其他技术与宏基因组技术的结合使用将有效改善这些问题。Kalyuzhnaya等［32］利用高通量快速测序研究华盛顿湖淤泥的碳循环，他们用13C复合物进行DNA-SIP 实验，随后利用纯化的标记DNA 建立宏基因组库，通过回收的13C-DNA 宏基因组库序列几乎重建了嗜甲基菌Methylotenera mobilis的完整染色体组。总之，全基因组鸟枪测序的宏基因组学方法可重建低丰度微生物的基因组和新陈代谢通路，但前提是需要结合DNA-SIP 技术。

同时，峰谷比（PTR）也可以用来检测微生物活性。峰谷比是一种可以在不同的生长条件和复杂的细菌群落中，提供一个定量的体内和体外生长速率测量方法的技术。该技术由Korem等［33］首次发现，随后Brown等［34］开发了复制指数（iRep）可以改进PRT技术。这个技术需要提供被检测微生物的复制起点信息，并需要根据实际情况，进行人工校正，目前使用并不广泛。

1.2 基于RNA水平的微生物原位活性检测方法

RNA-SIP是与DNA-SIP基本相同的一种分子生态学技术，采用稳定性同位素追踪环境中微生物的转录产物RNA。其原理和优缺点与DNA-SIP完全相同。

转录组测序能够全面快速的获取某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。转录组在广义上是指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，在狭义上则是指所有mRNA的集合。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。转录组学以微生物的全部mRNA为研究对象，所以会存在一些问题，如mRNA的含量较低，结构不稳定容易被降解等。随着新一代测序技术的产生，RNA-Seq（High-throughput RNA sequencing）随之而来，转录组学也得到了飞速的发展。Voorhies等［35］通过通过对休伦湖岛中污水池的蓝藻团进行宏基因组分析和环境转录组学分析，推断出了蓝藻和病毒的生态与遗传的互作关系。De Filipps等［36］通过环境转录组学对微生物对奶酪成熟速率的影响进行了研究，揭示了在温度推动下微生物的功能变化。为了了解导致大分子颗粒形成厌氧氨氧化生长增值机制，Bagchi等［37］结合环境转录组学、定量PCR和16S rRNA基因测序，对厌氧氨氧化颗粒状生物反应器中的群落组成、代谢基因组成和表达变化进行了分析，并提出了大颗粒形成的概念模型，这有助于今后采用厌氧氨氧化工艺进行废水处理。相信在未来的发展中，转录组学测序技术将会更好的与其他技术相结合，在生态学等领域获得更加广泛的应用。

1.3 基于氨基酸生物合成的微生物原位活性的检测

生物正交反应（Bioorthogonal reaction）是指一类可以在活体细胞中进行的化学反应。这类反应可以在生物体内的生理条件下发生，不会与体内同时发生的其他生化反应互相干扰，也不会对生物体和目标生物分子产生损伤。要完成生物正交反应，首先需要有可以参与正交反应的一对官能团，将其中一个参与正交反应的官能团引入目标蛋白；另一个参与反应的官能团与标记物进行连接，然后将两者进行正交反应，最后利用不同标记物的特性对目标蛋白的定位、结构和功能进行检测［38］。前期研究表明，生物正交非标准氨基酸标记（Bioorthogonal noncanonicalamino acid tagging，BONCAT） 技 术能对环境中功能微生物蛋白进行能有效地标记。Hatzenpichler等［39］用深海沉积物样品富集好氧嗜甲烷菌群，通过BONCAT标记确定其富集物主导类群为γ变形菌门的甲基球菌属，这些甲基球菌细胞的转化活性被认为依赖于富集培养时甲烷的添加。利用这种方法可以有针对性地研究在实验条件发生改变时特殊的标记蛋白所做出的反应。但这种方法在传统意义上来说，也只能用来研究某种生物的蛋白质组，一些新兴的技术将这种方法与其他方法耦合，希望能够使得这种方法得到更广泛的应用。Hatzenpichler等［7］将BONCAT与FACS结合，应用于甲烷厌氧氨氧化的研究中，对甲烷氧化菌的翻译活性进行了分类，并通过全基因组测序和16S RNA测序发现了一个新的古菌-细菌互作组合。这项技术与高通量技术的结合使用也展现出了非常好的前景，将有助于在微米分辨率下监测细胞翻译活动对环境信号的响应，并扩大高通量测序的尺度。当然，BONCAT也存在一定的局限性，如环境氨基酸吸收机制的多样性，添加的氨基酸的潜在影响等。希望在未来的改进或与其他技术结合后，能够有效地消除或减少这些限制性条件的影响。

2 选择合适的方法来检测原位微生物

微生物活性检测的结果，是由选择的方法和获取的参数产生的。在研究微生物在某一过程中所起到的作用时，我们无法对每一个细节都进行完整的评价，但也不可以仅仅在系统水平上进行概括性描述。所以，在我们设计相关的实验时，要将实际时间和空间条件的限制与各种待选方法的特性综合考虑，根据各种限制因素选择合适的方法来检测原位微生物（各方法比较详见表1）。在对微生物研究的过程中通常会面临一个非常重要的挑战，即确定微生物能产生作用的范围［44］，因为微生物产生影响的范围会决定检测方法的选择。例如，基于单细胞水平的检测技术不能为系统水平的鉴定与分类提供足够的数据支撑。因为选择不同检测方法对各种微生物细胞的分类可能会产生影响，所以在对实验设计进行评价之前，应该对每种检测方法进行评估，以确定特定种类的微生物群落所需要的研究方法。

表1 微生物原位检测方法的特征对比

3 展望

微生物生态学自产生以后，经过许多前辈的探索与发展，已经克服了传统微生物培养的限制，形成了一些比较系统的研究方法，使得我们对各种生态系统的了解更加的深入。随着各种检测方法的发展完善，检测结果会更加精确，这会让认识更加明确。同时检测费用的逐渐降低，也会让各种检测方法的使用更加广泛。地球上的各种生态系统复杂而庞大，包含的微生物种群也各有差异。各种原位检测方法对微生物生理生态做出了更加真实有效的描述，必将成为研究微生物生态的有力手段。

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Research Progress on in situ Detection Methods of Microorganisms

SONG Wei-feng LI Ming-cong GAO Zheng
（School of Life Science，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop Biology，Tai’an 271000）

As major participants in ecosystem material cycle and energy flow，microorganisms play an important role in the ecosystem.However，the proportion of the cultivable microorganism under the existing technology is very small，which limits the exploit of microbial resources. At present，there are a number of approaches that can avoid the problem of uncultured microorganisms，which are designed to study in situ microbial activity. Regarding this，we summarized some research methods of studying in situ microbial ecology，allowing it convenient to reasonably use these methods in the future. This article introduces the corresponding microbial detection methods of BrdU-labeling，DNA-SIP，fluorescence in situ hybridization（FISH），and environmental transcriptome from DNA level，RNA level and protein level，respectively，and compares their advantages and disadvantages. It also introduces how to apply these methods combined with popular high-throughput sequencing and single cell sequencing technology to capture the in situ activity of microbial groups. At the same time，comparing the characteristics of these methods，so that we can more clearly understand the choice of different methods under different scenarios. These modified methods combined with other methods will be conducive to solve many have-been or will-happen problems in the study of microbial ecology. The ecosystems on the earth are complex and huge，in which the microbial populations vary. A variety of in situ detection methods have made a more realistic and effective description for the physiology and ecology of microorganisms，which will become a powerful tool for the study of microorganisms.

microbial detection in sit；BrdU-labeling；DNA-SIP；fluorescence in situ hybridization；metagenome；transcriptome；BONCAT

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0550

2017-07-02

国家自然科学基金项目（41306150），山东省优秀中青年科学家科研奖励基金（BS2012HZ011），河口海岸学国家重点实验室开放课题（SKLEC-KF201603）

宋伟凤，女，研究方向：微生物生态；E-mail：songweifeng9719@qq.com，李明聪为共同第一作者

高峥，男，博士，副教授，研究方向：微生物生态与环境微生物学；E-mail：gaozheng@sdau.edu.cn

（责任编辑 狄艳红）