不同鸡品种BNK基因序列比较分析

陈 颖，郑圣晗，孔令琳，朱鹏飞，吴 允，郭其新，陈国宏，常国斌

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州225009)

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1648-1653

陈颖，郑圣晗，孔令琳，等. 不同鸡品种BNK基因序列比较分析[J].浙江农业学报，2017，29(10)： 1648-1653.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.08

2017-01-19

国家自然科学基金(31372297)；江苏省六大人才高峰项目(2015-NY-019)

陈颖(1991—)，女，山东菏泽人，硕士研究生，从事家禽遗传育种研究。E-mail: 984662816@qq.com

*通信作者，常国斌，E-mail: passioncgb@163.com

不同鸡品种BNK基因序列比较分析

陈 颖，郑圣晗，孔令琳，朱鹏飞，吴 允，郭其新，陈国宏，常国斌*

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州225009)

BNK(C-type lectin-like receptor 2)基因为C型凝结素受体基因中的抑制性基因，与禽类先天免疫性能关系密切。本研究以NCBI中GallusgallusBNK基因序列为参考，利用MEGA6软件对24个鸡品种的BNK基因进行序列比较分析，筛选出外显子和内含子上的SNPs位点、Indels以及氨基酸变化，并对24个鸡品种进行系统聚类。研究发现，SNPs位点大多发生在Exon3、Exon5和Exon6上，且多为错义突变。内含子上的SNPs位点大多发生在Intron1、Intron2和Intron4上。插入缺失发生在Intron2、Intron4和Exon5上，并且大多数品种Indels序列基本一致，国内外鸡品种之间并无显著差异。系统聚类分析将这些鸡品种分为3类，狼山鸡、罗斯鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡和如皋黄鸡为一类；其次，雪山鸡、安卡鸡、斗鸡和萧山鸡聚为一类；固始鸡单独为一类，表明固始鸡的BNK基因为单独起源。综上表明，BNK基因在我国地方鸡品种中具有丰富的遗传多样性，与不同鸡品种的先天免疫性能存在关联，这为家禽的免疫遗传学和抗病育种提供了参考依据。

鸡；BNK基因；抗病性；SNPs；Indels

BNK(Blec2)基因为C型凝结素受体基因中的抑制性基因，在胞内区含有一个单独的ITSM结构域，在淋巴组织中大量表达，而且是唯一证明表达于自然杀伤(natural killer，NK)细胞的C型凝结素受体蛋白基因[1]。鸡是非哺乳动物中禽类的代表动物，但是目前对鸡NK细胞的研究并不多，而鸡C型凝结素受体是最早发现的NK细胞受体，且C型凝结素在免疫应答中具有多种功能，起非常重要的作用[2-4]。研究表明，鸡C型凝结素受体与哺乳动物C型凝结素受体一样，分为抑制性受体和活化性受体，存在于3个不同的区域，位于16号染色体上的主要相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)(B基因座的B-F/B-L区域)便为其中一个[5-6]。研究发现，在类似于MHC区域的Rfp-Y区域有与Blec基因类似的凝集素类似物[7-8]。BNK基因与哺乳动物NKC(natural killer gene complex，自然杀伤基因复合体)中的基因，特别是小鼠的Nkrp1和C1r以及人类的NKR-P1 和LLT1， 从序列的结构、序列特征、基因起始、组织分布和对刺激的反应等都非常相似[9]。研究表明，BNK基因在NK细胞中的发现揭示了其可能在疾病的遗传抗性中扮演重要角色。但至今尚无关于鸡BNK基因的研究报道。本研究以24个鸡品种作为研究素材，利用目标序列捕获方法对BNK基因进行SNPs、Indels分析，为探明不同鸡品种的抗病性差异以及利用该基因进行抗病育种提供参考依据。

1 材料与方法

本研究采用24个鸡品种，其中仙居鸡(XJ)、大骨鸡(DG)、茶花鸡(CH)、鹿苑鸡(LU)、藏鸡(ZJ)、白耳鸡(BE)、河南斗鸡(DJ)、固始鸡(GS)、狼山鸡(LS)、泰和乌骨鸡(WG)、萧山鸡(XS)、北京油鸡(BY)这12个地方鸡品种均来自中国农业科学研究院家禽科学研究所国家地方禽种资源基因库。另外，罗斯鸡(RS)、隐性白羽肉鸡(YB)、安卡鸡(AK)、来航鸡(LH)、如皋黄鸡(RG)、雪山鸡(XC)、文昌鸡(WC)、太湖鸡(TH)、溧阳鸡(LY)、东乡绿壳蛋鸡(LD)、广西黄鸡(GXH)以及青脚麻鸡(QM)这12个鸡品种均来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室的禽种资源基因库。

利用翅静脉采血法采集2 mL血液，每个品种10个样本，放入具有肝素钠的采血管中，加入裂解液，4 ℃保存，用苯酚和氯仿法从血液中提取DNA。将每个品种的DNA混合样品送深圳华大基因公司进行目标序列捕获测序，然后利用MEGA6软件与从GenBank中检索参考基因的编码cDNA进行核苷酸序列比较，分析核苷酸突变位点和插入缺失位点以及氨基酸变化情况。各个鸡品种的外显子和内含子的起始位点、终止位点和参考序列一致。

2 结果与分析

2.1不同鸡品种BNK基因的SNPs位点和Indels位点分析

为了探究我国不同地方鸡品种的BNK基因，查阅NCBI上Gallusgallus(Gene ID:693259)BNK基因的编码cDNA序列，并以此为参考。通过对比可知，在24个鸡品种中BNK基因外显子上有18个SNPs和18个Indels位点，内含子上有48个SNPs和41个Indels位点(表1)。

对24个鸡品种外显子进行SNPs位点分析，BNK基因的SNPs位点主要位于Exon6上(表2)。河南斗鸡、固始鸡、泰和乌骨鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、青脚麻鸡和溧阳鸡的突变位点一样，均发生在Exon6上，且导致氨基酸错义突变。太湖鸡、广西黄鸡和来航鸡的突变位点一致，位于Exon5上，为错义突变。大骨鸡和雪山鸡的突变均在Exon3上。青脚麻鸡有2个SNPs位点，固始鸡有5个SNPs位点，其他的鸡品种无SNPs位点。Exon2上的SNPs位点只在固始鸡和青脚麻鸡中发现，且氨基酸序列为同义突变。国外鸡品种中罗斯和隐性白羽肉鸡均没有发现SNPs位点。

对不同鸡品种BNK基因内含子做SNPs位点分析(表3)。内含子上的SNPs位点主要发生在Intron1、Intron2和Intron4上，其中包括河南斗鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、青脚麻鸡、溧阳鸡、来航鸡等，而固始鸡内含子上有9个SNPs位点，在所有鸡品种中最多，位于Intron1、Intron2、Intron3、Intron4和Intron5上。其他鸡品种，包括罗斯鸡和隐性白羽肉鸡均没有发现SNPs位点。

表1BNK基因外显子和内含子上SNPs分布情况

Table1Distribution of SNPs in exons and introns ofBNKgene

位置Sites范围Range长度Size/bpSNPs个数NumbersofSNPs百分比Percentage/%外显子1Exon1122774～1228467300外显子2Exon2123605～123688842238外显子3Exon3124069～1242031353222外显子4Exon4124280～1244341532131外显子5Exon5124964～1250671043288外显子6Exon6125140～1252661278630内含子1Intron1122846～12360576015197内含子2Intron2123688～12406938213340内含子3Intron3124203～124280781128内含子4Intron4124434～12496453117320内含子5Intron5125067～125140742270

百分比(%)为每个外显子、内含子上的SNPs个数占各自长度的比例。

Percentage (%) is the proportion of SNPs to the introns and exons， respectively.

表2不同鸡品种BNK基因外显子上SNPs位点分布

Table2Distribution of SNPs inBNKgene of different breeds

鸡品种Chickenbreeds外显子ExonSNPs氨基酸Aminoacid固始鸡(GS)2123682A/G—固始鸡(GS)3124149A/GQ/R固始鸡(GS)4124340G/AG/S固始鸡(GS)4124358A/GR/G固始鸡(GS)6125231A/CK/Q雪山鸡(XC)3124164T/CV/A大骨鸡(DG)3124164T/CV/A安卡鸡(AK)6125264T/CK/Q青脚麻鸡(QM)2123682A/G—青脚麻鸡(QM)6125231A/CK/Q太湖鸡(TH)5125037T/GL/W广西黄鸡(GXH)5125037T/GL/W来航鸡(LH)5125037T/GL/W河南斗鸡(DJ)6125231A/CK/Q泰和乌骨鸡(WG)6125231A/CK/Q萧山鸡(XS)6125231A/CK/Q鹿苑鸡(LU)6125231A/CK/Q溧阳鸡(LY)6125231A/CK/Q

“/”前的表示突变前的碱基或氨基酸，“/”后的表示突变后的碱基或氨基酸；—表示未发生变化，数字表示发生突变的位点。表3同。

The base or amino acid before mutation were before “/”， the base or amino acid after mutation were after “/”;-indicated no change， Numbers indicated the site of the mutation. The same as Table 3.

在不同鸡品种BNK基因的Indels分布中，国内外鸡品种之间并无显著差异。在Intron2上，与参考序列相比，除了鹿苑鸡和安卡鸡未发生变化，其他鸡品种均在123 825～123 833位点上发生缺失，缺失序列为GCACTCAGT。同时在Intron4上，除了来航鸡、文昌鸡、安卡鸡、泰和乌骨鸡和萧山鸡未发生变化，其他鸡品种均在124 440～124 442位点上发生CAT序列的缺失。对于Exon5，除了狼山鸡、固始鸡、东乡绿壳蛋鸡、广西黄鸡、来航鸡和仙居鸡未发生变化，其他鸡品种均在124 992～124 998位点上发生AGATGCA序列的插入。

表3不同鸡品种BNK基因内含子上SNPs位点分布

Table3Distribution of SNPs in introns ofBNKgene in different breeds

鸡品种Chickenbreeds内含子IntronSNPs河南斗鸡(DJ)1123585G/A河南斗鸡(DJ)2123988A/G河南斗鸡(DJ)4124505T/C河南斗鸡(DJ)4124832A/G河南斗鸡(DJ)4124883A/T如皋黄鸡(RG)1123585G/A文昌鸡(WC)1123585G/A白耳鸡(BE)1123585G/A固始鸡(GS)1123585G/A固始鸡(GS)2123936A/G固始鸡(GS)2123988A/G固始鸡(GS)3124216T/C固始鸡(GS)4124505T/C固始鸡(GS)4124690G/A固始鸡(GS)4124883A/T固始鸡(GS)5125151A/G固始鸡(GS)5125159C/T泰和乌骨鸡(WG)1123585G/A泰和乌骨鸡(WG)2123988A/G泰和乌骨鸡(WG)4124832A/G泰和乌骨鸡(WG)4124883A/T雪山鸡(XC)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T萧山鸡(XS)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T鹿苑鸡(LU)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T安卡鸡(AK)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T青脚麻鸡(QM)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T太湖鸡(TH)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T溧阳鸡(LY)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T广西黄鸡(GXH)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T来航鸡(LH)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T

BNK基因的插入缺失发生在Intron2、Intron4和Exon5上。且大多数鸡品种Indels序列基本一致，

表4不同鸡品种BNK基因的Indels分布

Table4Indels distribution ofBNKgene in different breeds

鸡品种Chickenbreeds内含子2 Intron2起始位点Initiationsites插入缺失Indel内含子4 Intron4起始位点Initiationsites插入缺失Indel外显子5 Exon5起始位点Initiationsites插入缺失IndelRS123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCALS123825D/GCACTCAGT124440D/CATDJ123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCARG123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCAGS123825D/GCACTCAGT124440D/CATZJ123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCAWG123825D/GCACTCAGT124992I/AGATGCAXC123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCAXS123825D/GCACTCAGT124992I/AGATGCAYB123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCACH123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCALU124440D/CAT124992I/AGATGCAAK124992I/AGATGCABY123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCADG123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCAWC123825D/GCACTCAGT124992I/AGATGCAQM123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCATH123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCALY123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCALD123825D/GCACTCAGT124440D/CATGXH123825D/GCACTCAGT124440D/CATLH123825D/GCACTCAGTXJ123825D/GCACTCAGT124440D/CATBE123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCA

D和I分别表示碱基缺失和插入，“/”后面表示缺失和插入的序列。

D and I are base deletions and insertions， “/” after that are the deletions and insertions sequence.

2.2 不同鸡品种BNK基因系统聚类分析

将不同鸡品种的BNK基因用MEGA6软件构建UPGMA进化树。从图1中可以看出，24个鸡品种大致分为3类，狼山鸡、罗斯鸡、隐性白羽肉鸡等为一类；其次，雪山鸡、安卡鸡、斗鸡等聚为一类；固始鸡单独为一类，表明固始鸡BNK基因为单独起源。我国地方鸡品种中BNK基因具有丰富的遗传多样性，不同鸡品种的先天免疫性能存在显著差异。

图1 不同鸡品种UPGMA进化树分析Fig.1 UPGMA phylogenetic tree analysis of different breeds

3 讨论

MHC长期以来被认为是识别对疾病易感和耐受的免疫反应系统，尤其与MD(Marek’s disease，马立克氏病)密切相关。但是目前对BNK基因的功能尚不清楚。有假说认为BNK受体以单倍型特异方式识别优势表达的MHC I类分子，进而解释不同MHC单倍型鸡对MD的抗性[10-12]。本研究发现，BNK基因在不同品种之间存在着多处SNPs位点和Indels位点，外显子发生SNPs位点有18个，内含子发生SNPs位点有48个，外显子中除了Exon2上的为同义突变，其他均为错义突变。国外鸡品种的遗传变异均可在我国地方鸡品种中找到，例如安卡鸡突变位点均发生在Exon6上，与此类似的品种有：河南斗鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、溧阳鸡等。并且从聚类分析中可以看出，萧山鸡、鹿苑鸡和溧阳鸡分为一类，且均分布在江浙地区，抗病性强。吴信生[13]利用微卫星技术分析地方鸡品种间亲缘关系时得出，鹿苑鸡和萧山鸡分为一类，白耳鸡、大骨鸡和狼山鸡聚为一类，固始鸡单独为一类，这与本研究结果基本一致。对于萧山鸡和鹿苑鸡聚为一类这一分析结果，张学余等[14]利用29个微卫星标记构建的4类聚类图中，萧山鸡和鹿苑鸡聚为一类。总体来看，在外显子上发生SNPs的13个鸡品种中有8个发生在Exon6，并均为A/C的突变。所以Exon6在BNK基因上起重要作用，拥有丰富的多态性。罗斯鸡、隐性白羽肉鸡无论在外显子还是内含子均无SNPs位点，这可能是我国地方品种与外来品种抗病力存在差异的原因；罗斯鸡与隐性白羽肉鸡作为现代主要肉鸡品种，具有生长速度快，饲料报酬高的特点，但同时也存在抗病力尤其是先天免疫性能相对较差的问题，BNK基因上SNPs位点的缺失可能是影响因素之一。相对国外鸡品种，我国地方鸡品种的BNK基因遗传变异更加丰富，真实反映了我国地方鸡品种先天免疫基因资源丰富、适应性强、耐粗饲的特点。

研究表明，基因中内含子虽然不参与编码蛋白质，但是内含子对于编码序列和蛋白质的调控都有重要的作用[15]。在本研究中，24个鸡品种中BNK基因的内含子发生SNPs位点有48个，Indels位点41个。安卡鸡、萧山鸡以及鹿苑鸡在Intron1、Intron2、Intron4上均具有SNPs位点，并且抗病力强，这与王存波等[16]的研究一致。从研究结果可知，北京油鸡和狼山鸡均无SNPs位点，并且抗病性弱，这与张娇等[17]的研究结果一致。在系统聚类中，24个鸡品种分为3大类，但不同品种间置信度水平并不高，这是由于该基因变异度高导致不同鸡品种之间的同源性低，究其原因可能与我国地方多种生态类型、种群演变历史以及丰富的遗传多样性有关，例如观赏性的河南斗鸡、药用的乌骨鸡[18-19]。这也可能与地理位置和当地的长期历史文化有关，进一步表明BNK基因能够有效反映我国地方鸡品种的多源性进化及丰富的遗传多样性。从聚类分析结果可知，固始鸡为单独一类，并且与其他鸡品种相比，固始鸡的SNPs位点最多，表现出最为丰富的遗传多样性。特别是在Exon2和Intron3相关序列上，是其他鸡品种缺少的变异，这可能与悠久的驯化历史以及良好的资源保护有关。邓雪娟等[20]的研究表明，通过微卫星技术分析得知，固始鸡具有较高的群体杂合度，遗传多样性较高。同时根据文凤云等[21]报道，固始鸡具有耐粗饲、先天免疫性能好、抗病力强、肉质鲜美等特点，是我国著名的肉蛋兼用型地方优良鸡品种，这可能与固始鸡中BNK基因丰富的遗传多样性有关。但是这些位点是否与不同鸡品种之间的先天免疫性能差异存在关联还需要进一步研究。

综上，BNK基因在国内外鸡品种中存在多种遗传变异，其中SNPs位点有66个，Indels位点59个，尤其在我国地方鸡品种中表现出极其丰富的遗传多样性，这对研究我国地方鸡品种优良的先天免疫性能的遗传机制以及开发、利用这些丰富的免疫基因资源，从而为提高鸡的抗病性与实现无抗养殖提供了基础资料。

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ComparativeanalysisofBNKgenesequencesindifferentchickenbreeds

CHEN Ying， ZHENG Shenghan， KONG Linglin， ZHU Pengfei， WU Yun， GUO Qixin， CHEN Guohong， CHANG Guobin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

TheBNK(C-type lectin-like receptor 2) gene is an inhibitory receptor expressed on natural killer cells， which is closely related to the innate immune function of poultry. In this study， according to NCBI 5.0Gallusgallus， we used MEGA6 software to analyzeBNKgene in 24 types of chickens. We found several SNPs， Indels and amino acids on exons and introns. In addition， we performed the clustering in 24 chickens via MEGA6. The results showed that most of the SNPs sites occurred on Exon3， Exon5 and Exon6， and most of them were missense mutations. The SNPs sites mostly occurred on Intron1， Intron2 and Intron4. And then the Indels mostly occurred on Intron2， Intron4 and Exon5. There was no significant difference between domestic and foreign chicken breeds， and most of the Indels sequences were basically the same. By cluster analysis the chickens were divided into three groups， Langshan chicken， Ross chicken， Recessive white chicken， Chahua chicken and Rugao yellow chicken as a class; Xueshan chicken， Anka chicken， Dou chicken and Xiaoshan chicken as a class; Gushi chicken as a class. According to clustering analysis，BNKgene of Gushi chicken was a single origin. In conclusion，BNKgene has abundant genetic diversity in Chinese chicken breeds and there was close relation in innate immunity with different chicken breeds， which provide reference for immune genetics and disease resistance breeding of poultry.

chicken;BNKgene; disease resistance; SNPs; Indels

S831.2

A

1004-1524(2017)10-1648-06

（责任编辑张 韵)