粉防己碱对酮康唑抗近平滑念珠菌复合体的体外增效活性研究

赵亚婧 李水秀 蒋玲 宋延君 郭慧 刘维达 沈永年 朱坤举 张宏

510632广州，暨南大学附属第一医院真菌病研究所（赵亚婧、李水秀、蒋玲、宋延君、郭慧、朱坤举、张宏）；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所真菌科（刘维达、沈永年）

粉防己碱对酮康唑抗近平滑念珠菌复合体的体外增效活性研究

赵亚婧 李水秀 蒋玲 宋延君 郭慧 刘维达 沈永年 朱坤举 张宏

510632广州，暨南大学附属第一医院真菌病研究所（赵亚婧、李水秀、蒋玲、宋延君、郭慧、朱坤举、张宏）；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所真菌科（刘维达、沈永年）

目的探讨粉防己碱在体外对酮康唑抗近平滑念珠菌复合体有无增效作用。方法参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的M27⁃A3方案，采用棋盘式微量稀释法测定酮康唑单独及联合粉防己碱抗21株近平滑念珠菌复合体临床株抗真菌活性，结合部分抑制浓度指数（FICI）对结果进行评价；以甲基四氮盐（XTT）法分别测定不同时间点药物作用的效果，绘制时间杀菌曲线，动态观察药物体外抗近平滑念珠菌复合体活性。结果粉防己碱与酮康唑单独作用于21株近平滑念珠菌复合体菌株的最低抑菌浓度分别是32～64 mg/L和0.031 25～2 mg/L，两药联合时最低抑菌浓度分别降至2～8 mg/L和0.008～0.25 mg/L，FICI值为0.09～0.5；时间杀菌曲线表明，与酮康唑单用组和粉防己碱单用组相比，酮康唑联合粉防己碱组真菌生长延迟明显。结论粉防己碱在体外对酮康唑抗近平滑念珠菌复合体有明显的增效作用。

念珠菌属；酮康唑；粉防己碱；药物协同作用；近平滑念珠菌复合体

念珠菌感染的全球流行病学状况正在发生变 化［1］。近年来，近平滑念珠菌复合体（Candidaparapsilosiscomplex，简称近平滑念珠菌）等非白念珠菌的发病率和病死率逐年升高［2⁃4］。在拉美、欧洲和亚太等部分地区，近平滑念珠菌已经成为第二常见的侵袭性致病念珠菌［5］。唑类药物，如酮康唑（ketoconazole，KCZ），对念珠菌有较强的抗菌活性，是临床上治疗念珠菌感染的常用抗真菌药物，但伴随其广泛、长期使用，耐药菌株有明显增多趋势［6］，已经成为困扰临床的重要难题。

粉防己碱（tetrandrine，TET）是天然药用植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，临床上具有抗炎、抗肿瘤、降低门脉高压等作用，近年来我们课题组已证明其对氟康唑等唑类抗真菌药物在体内外抗白念珠菌、烟曲霉等均有显著增效活性，作用机制与抑制药物外排泵基因有关［7⁃8］。本实验中我们以21株近平滑念珠菌临床株作为非白念珠菌代表，体外研究TET对KCZ的增效活性，为临床上以TET作为唑类药物增效剂治疗念珠菌病提供实验室依据。

材料和方法

一、菌株和主要试剂

21株近平滑念珠菌临床分离株（JS425、JS426、JS427、JS428、JS429、JS430、JS431、JS432、JS433、JS434、JS436、JS437、JS439、JS440、JS441、JS442、JS443、JS444、JS445、JS446、ATCC22019）均来自于中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心。质控菌株选用美国临床和试验标准协会（CLSI）推荐的近平滑念珠菌ATCC 22019。KCZ（纯度＞98.5%，由西安杨森制药有限公司提供，批号P006766）；TET（批号 T2695，纯度＞98%，美国Sigma公司）。

二、方法

1.菌悬液和药液制备：将受试菌株于沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）中35℃转种2次，挑取单个较大菌落用生理氯化钠溶液配制菌悬液，以中国细菌标准浊度管比浊，调整至工作浓度为（0.5～2.5）×103cfu/ml，菌液新鲜制备［9］。KCZ 用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成4 g/L的储备液；TET用灭菌双蒸水和0.1 mg/L HCl溶解，配制成浓度为3 g/L的储备液。

2.测定TET、KCZ单独对近平滑念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）：根据CLSI⁃M27 A3酵母菌液基微量稀释法［10］进行测定。用RPMI 1640液体培养基将药物储备液稀释至2倍工作浓度。取100 μl倍比稀释后依次加入96孔板的第2～11列；第1列为生长对照；第12列为空白对照。除第12列外，其余各孔再分别加入100 μl菌悬液至工作浓度（0.5～2.5）×103cfu/ml。将制备好的96孔板置35℃恒温培养箱中培养48 h，用酶标仪测定吸光度A490值，确定MIC值。计算公式如下：真菌生长百分率=（各孔A值-空白对照孔A值）/（生长对照孔A值-空白对照孔A值）× 100%［11⁃12］。真菌生长抑制百分数 =（1- 真菌生长百分数）×100%。取真菌生长抑制百分数在80%以上的最低药物浓度为MIC值。实验重复进行3次。

3.TET与KCZ联合抗近平滑念珠菌活性测定：参照 CLSI M27⁃A3［10］方案，以棋盘法测定 TET 与KCZ联合对21株近平滑念珠菌的体外抗真菌活性。通过上述实验确定TET与KCZ的适当浓度范围，以RPMI 1640液体培养基分别将两种药物储备液稀释至4倍工作浓度（终浓度范围分别是：TET 4～256 mg/L，KCZ 0.008～8 mg/L）。按照浓度从低到高的顺序，取倍比稀释的KCZ和TET药液各50 μl分别加入96孔板的第2～12列和第A～G行。除A12孔之外，其余各孔再分别加入菌悬液100 μl。不足200 μl液体的孔用RPMI 1640液体培养基补足。将制备好的96孔板置于35℃恒温培养箱中培养48 h，根据吸光度A490值判读结果。实验重复进行3次。采用部分抑制浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）评价两药相互作用。计算公式如下：FICI=MICAB/MICA+MICBA/MICB，式中的MICA和MICB分别表示药物A和B单用时的MIC值，MICAB和MICBA分别表示两种药物联用时各自的MIC值。当FICI≤0.5时，两药相互作用为协同作用，FICI≤4且＞0.5时为无关作用，＞4时为拮抗作用［13］。以KCZ MIC ≤ 0.125 mg/L为敏感（S），0.25～0.5 mg/L为剂量依赖性敏感（SDD），≥1 mg/L为耐药（R）［14］。

4.时间-杀菌曲线测定：以耐药株JS431和敏感株JS440为测试菌株，参照前期研究方法［13］，以RPMI 1640液体培养基将菌液稀释至1×105cfu/ml工作浓度。以各试验菌株MIC值的试验结果为依据，配制含TET和KCZ的RPMI 1640液体培养基。分别在50 ml无菌离心管中制备生长对照组（不加药）、TET单用组、KCZ单用组和TET与KCZ联合用药组，每个体系总体积为5 ml。将各作用体系于37 ℃静置培养，并于药物作用开始后0、6、12、24、48 h分别从各作用体系中连续3次吸取菌液100 μl加入到96孔平板内，每孔中再加入配好的甲基四氮盐（XTT）-甲萘醌溶液100 μl，37 ℃避光培养2 h，用酶标仪测定A490值。实验重复3次，取平均值。以培养时间（h）为横坐标，每一时间测定点A490的均数为纵坐标，绘制时间-杀菌曲线。

结 果

一、KCZ单独及联合TET抗近平滑念珠菌活性

TET与KCZ单独或联合作用于21株近平滑念珠菌的MIC值见表1。

实验所用的21株近平滑念珠菌中，JS431、JS439为KCZ耐药株，JS432、JS442、JS443为剂量依赖性敏感株，其余均为KCZ敏感株。单独用药时，KCZ和TET的MIC值范围为0.031 25～2 mg/L和32～64 mg/L，联合用药后分别降至0.008～0.25 mg/L和2～8 mg/L，FICI值为0.09～0.5，均表现为协同作用（表1）。两药联合时，其MIC终点清晰，“拖尾现象”消失。

二、时间杀菌曲线

见图1，2。结果显示TET单独使用时对生长曲线几乎无影响，抗真菌作用极弱。在药物作用6 h前，各组之间的生长曲线几乎重合。而6 h后，含有KCZ的各组生长曲线出现生长延迟，KCZ与TET联 用组更明显。在24 h和48 h时，耐药株（JS431）与敏感株（JS440）中KCZ和TET联用组比KCZ单独作用组的A值均下降至少2倍。

表1 粉防己碱（TET）与酮康唑（KCZ）单独或联合对21株近平滑念珠菌的体外抗菌活性

图1 酮康唑与粉防己碱联用抗耐药近平滑念珠菌株JS431的时间-杀菌曲线图

图2 酮康唑与粉防己碱联用抗敏感近平滑念珠菌株JS440的时间-杀菌曲线图

讨 论

唑类药物作为目前治疗和预防念珠菌感染最广泛使用的抗真菌药物，其耐药菌株的大量检出对抗真菌药物的研究提出了新的挑战。据全球性研究ARTEMIS念珠菌监测项目显示，近平滑念珠菌的分离率和对唑类药物的耐药率分别由2000年前的4.8%、2.5%升至2000年后的6.9%和3.5%。中国首个真菌耐药监测网CHIF⁃NET 2010项目中，分离出的近平滑念珠菌株数占总分离念珠菌总数的17.7%，对唑类药物的耐药率为1.4%［6，15］。因此，减缓菌株耐药性的产生已成为抗真菌药物研究的新主题。我国植物资源物种丰富，大量学者从传统中药中发现能够增强唑类药物抗念珠菌活性的成分，且体外协同抗真菌作用的机制研究多数是针对白念珠菌的。然而目前为止，尚未发现市面上存在一种安全、有效且作用机制明确的抗真菌药物增效剂，尤其针对非白念珠菌的相关研究更为缺乏。

我们使用棋盘式微量液基稀释法检测TET与KCZ联用抗近平滑念珠菌的MIC，结果发现TET在体外单独用药时抗真菌活性极弱，但当与KCZ联用时，KCZ的MIC值降低3～7个梯度，TET自身的MIC也降低3～5个梯度，FICI值介于0.09～0.5之间，表现出良好的协同作用。时间-杀菌曲线法以耐药株JS431和敏感株JS440为研究对象，我们发现TET单独使用时对生长曲线几乎无影响，当其与KCZ联合时能显著增强KCZ的抗真菌活性，与棋盘法所得结果具有良好的一致性。结合本研究及本课题组前期研究，TET是一种具有应用前景的抗真菌药物增效剂，这不仅为临床以TET作为KCZ增效剂治疗近平滑念珠菌病提供了科学依据，也为我们进一步研究TET对唑类药物的增效活性及机制打下基础。

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In vitro synergistic effect of tetrandrine on ketoconazole against Candida parapsilosis complex

Zhao Yajing,Li Shuixiu,Jiang Ling,Song Yanjun,Guo Hui,Liu Weida,Shen Yongnian,Zhu Kunju,Zhang Hong
Institute of Mycology,The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510632,China（Zhao YJ,Li SX,Jiang L,Song YJ,Guo H,Zhu KJ,Zhang H）;Department of Mycology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Liu WD,Shen YN）

s:Zhu Kunju,Email:zhukunju1111@163.com;Zhang Hong,Email:tzhangh@jnu.edu.cn

ObjectiveTo evaluate thein vitrosynergistic effect of tetrandrine on ketoconazole againstCandida parapsilosiscomplex.MethodsAccording to the Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）M27⁃A3 guidelines,the microdilution checkerboard method was used to evaluatein vitroantifungal activities of ketoconazole alone and in combination with tetrandrine against 21 clinical isolates ofCandida parapsilosiscomplex based on the fractional inhibitory concentration index（FICI）.Antifungal effects of the above drugs at different time points were evaluated by the XTT assay,and then time⁃killing curves were drawn and assessed to investigate thein vitrodynamic antifungal activity.ResultsThe minimum inhibitory concentrations（MICs）of tetrandrine and ketoconazole alone against 21 clinical isolates ofCandida parapsilosiscomplex were 32-64 mg/L and 0.031 25-2 mg/L,respectively.When ketoconazole was combined with tetrandrine,MICs of tetrandrine and ketoconazole were reduced to 2-8 mg/L and 0.008-0.25 mg/L respectively,and the FICI ranged from 0.09 to 0.5.The time⁃killing curves revealed that the fungal growth was delayed obviously in the combination group compared with the ketoconazole alone group and tetrandrine alone group.ConclusionTetrandrine has obvious synergistic effects on ketoconazole againstCandida parapsilosiscomplexin vitro.

Candida;Ketoconazole;Tetrandrine;Drug synergism;Candida parapsilosiscomplex

朱坤举，Email：zhukunju1111@163.com；张宏，Email：tzhangh@jnu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.06.007

国家自然科学基金（81171542、81471995）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81171542,81471995）

2016⁃10⁃11）

（本文编辑：尚淑贤）