人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的建立及其耐药机制研究

(开封市祥符区第一人民医院,河南 开封 475100)

人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的建立及其耐药机制研究

石动菊

(开封市祥符区第一人民医院,河南 开封 475100)

目的建立紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol, 探讨卵巢癌紫杉醇获得性耐药潜在的分子机制。方法以人卵巢癌细胞株SKOV-3为亲本细胞，采用紫杉醇(Taxol)浓度梯度递增法诱导建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol。光学显微镜及电子显微镜观察细胞形态，MTT法检测细胞药物敏感性，流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡水平, 实时荧光定量PCR和Western Blot方法分别检测多药耐药基因以及凋亡和细胞周期调控相关基因的转录和翻译水平。结果建立的紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol对紫杉醇具有显著耐药性，对阿霉素及5-氟脲嘧啶(5-FU)也产生强烈的交叉耐药，细胞形态也发生明显的变化。与亲本细胞相比，SKOV-3/Taxol细胞G2/M阻滞明显低于SKOV-3，其凋亡率也显著低于SKOV-3，差异均有统计学意义(P< 0.05 )，耐药细胞株中MRP1、MAP-Tau和CDK1基因表达水平显著提高。结论成功建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的基础上，多药耐药相关蛋白MRP1、微管相关蛋白MAP-Tau以及细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)基因过表达与卵巢癌细胞对紫杉醇耐药有关。

紫杉醇；多药耐药；卵巢癌； SKOV-3/Taxol 细胞株；MRP1

紫杉醇(PacliTaxol,Taxol)是从红豆杉树皮中提取的一种抗肿瘤药物[1]，它对大多数实体瘤尤其对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等具有显著的抗癌活性，对卵巢癌[2，3]、子宫颈癌、肺癌和白血病等恶性肿瘤也有一定疗效，但耐药的产生极大地限制了其临床疗效和应用范围。紫杉醇的作用靶点是构成细胞骨架的微管，主要通过促进微管蛋白迅速合成微管及阻止其解聚，将肿瘤细胞阻遏在G2期和M期，从而抑制其有丝分裂，最终导致肿瘤细胞死亡[4]。目前紫杉醇耐药细胞株的体外研究主要集中在乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、食管癌和肝癌等，而卵巢癌紫杉醇耐药的体外研究较为少见。为此，本文拟采用浓度梯度递增法建立紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol，并对其生物学特性进行研究，以进一步探讨卵巢癌细胞中紫杉醇获得性耐药发生的新机制。报告如下。

1 资料与方法

1.1 细胞株

实验采用的SKOV-3细胞株购自中国科学院上海细胞库。SKOV-3/Taxol为本室采用紫杉醇浓度梯度递增法诱导建立的卵巢癌耐药细胞株，能在含紫杉醇浓度为0.7 μmol/L和1.5 μmol/L的培养基中长期稳定生长的细胞分别被命名为SKOV-3/Taxol 0.7和SKOV-3/Taxol 1.5。

1.2 细胞培养

人卵巢癌细胞株SKOV-3培养于含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的PRMI-1640培养液中，于37℃含5% CO2培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代，3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 观察方法

通过倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学变化并照相。收集培养的细胞用4°C预冷的2%戊二醛固定2 h，再用0.1M二甲砷酸钠缓冲液换液3次，每次2 h。之后用1%锇酸4°C固定2 h，用0.1M二甲砷酸钠缓冲液换液2次，每次15 min。接着梯度酒精脱水，环氧丙烷渗透，包埋，制备超薄切片，透射电镜观察细胞超微结构。

1.4 流式细胞仪检测

用碘化丙锭(PI)4℃避光染色30 min,300目尼龙筛网过滤后，用BD Accuri C6流式细胞仪进行测试，以488 nm为激发光源检测细胞，用MODFIT LT 3.0软件分析比较细胞周期分布变化。细胞凋亡检测按美国BD公司Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明书进行。

1.5 实时荧光定量PCR 法检测

Trizol法提取SKOV-3和SKOV-3-Taxol细胞总RNA， RT-PCR 试剂盒逆转录制备cDNA，进行PCR扩增。 2-△△CT法计算mRNA的相对表达量，以GAPDH作为内参。每个实验组重复3次。

1.6 Western blot

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 SKOV-3/Taxol耐药细胞模型的建立

MTT检测结果表明，SKOV-3/Taxol对紫杉醇具有显著耐药性，SKOV-3/Taxol 0.7与SKOV-3/Taxol 1.5对紫杉醇的耐药指数分别为31.38和42.32，为高度耐药；此外，它们对阿霉素(ADR)及5-氟尿嘧啶(5-FU)也产生强烈的交叉耐药(见表1)。

表1 SKOV-3 和SKOV-3/Taxol对不同化疗药物的IC50及耐药指数

注：1)与对照组比较，P<0.05；2)两组比较，P<0.05

2.2 细胞形态学变化

在倒置相差显微镜下观察，可见对照组SKOV-3细胞株贴壁良好，细胞呈梭形或多边形，少量圆形，胞体透亮，状态佳；而SKOV-3/Taxol耐药细胞株贴壁较差，细胞形状欠规则，圆形或椭圆形细胞增多，细胞折光性差，较暗，细胞内颗粒增多。经包埋、染色、切片后荧光显微镜下观察，SKOV-3细胞大小较均一，边界清楚，染色均匀；而SKOV-3/Taxol耐药细胞大小不一，形态不规则，边界欠清，并出现双核、多核现象，核内染色加深。见图1。透射电镜下观察发现亲本细胞SKOV-3胞浆少，细胞核大，胞浆内可见散在游离核糖体，细胞表面布满不规则的微绒毛；而耐药细胞SKOV-3/Taxol则胞核变小，核浆比例减小，胞浆内空泡结构明显增多，游离核糖体聚集且数量增多，线粒体数量增多，细胞表面可见大量的小球状隆起。见图1。

11:36 2017-10-26图1SKOV-3和SKOV-3-Taxol细胞形态(x200)和细胞超微结构(x1 000)

2.3 细胞周期分布

相较于亲本细胞SKOV-3，SKOV-3-Taxol 0.7耐药细胞的G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少。SKOV-3-Taxol细胞的G2/M期阻滞明显低于SKOV-3(P<0.05)，见图2A。细胞凋亡结果分析本研究结果显示经1.5 umol/L紫杉醇处理24 h后，SKOV-3细胞产生非常明显的凋亡现象，凋亡细胞迅速增加，且不断进入凋亡后期的坏死阶段；与此相反，SKOV-3-Taxol细胞凋亡明显受到抑制, 其凋亡率显著低于SKOV-3细胞(P<0.05)，见图2。

图2SKOV-3和SKOV-3-Taxol细胞生长曲线和和细胞周期分布图

2.4 Real-time PCR结果分析

分别检测亲本与耐药细胞株多药耐药相关基因(Mdr1、MRP1、LRP、GST-π、ToPo II)、凋亡抑制基因Bcl-2、β微管蛋白III 型(TUBB3)基因、微管相关蛋白Tau(MAP-Tau)基因、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)基因以及TP53等10个基因mRNA表达水平。 Real-time PCR结果显示，与亲本细胞相比，SKOV-3/Taxol耐药细胞株中MRP1、MAP-Tau、CDK1以及MDR1基因mRNA的转录水平分别升高37倍、8倍、4.6倍和2倍；GST-π、LRP、TUBB3基因mRNA的转录水平下降了1-3倍，而TP53、ToPo II基因转录水平则无明显变化，见图3。采用Western Blot结果与其mRNA的转录水平基本保持一致。见图3。

图3 Real Time PCR和Western Blot检测耐药基因的表达

3 讨论

本文结果显示建立的SKOV-3/Taxol耐药细胞株对紫杉醇高度耐药，且能够长期稳定生长，冻存或撤药后仍能保持较高的耐药性。细胞周期G2/M阻滞下降与细胞凋亡减少可能是卵巢癌细胞紫杉醇耐药的机制之一，这一结果与以往的报道一致[5,6]。

P-gp 过表达被认为是紫杉醇耐药的常见机制之一[7]，MAP-Tau是近年来研究较为深入的一种影响紫杉醇敏感性的微管蛋白，Tau蛋白表达水平较高时，可导致紫杉醇的结合减少，从而表现出紫杉醇耐药[8]。本研究发现SKOV-3-Taxol细胞内MAP-Tau基因表达量提高8倍，进一步证实了Tau蛋白表达水平与紫杉醇耐药相关。

肿瘤多药耐药的产生机制十分复杂，可能涉及多种因素和机制，但哪些因素或环节起到关键性作用还不是很清楚。本研究在成功建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的基础上，证实了多药耐药相关蛋白MRP1、微管相关蛋白MAP-Tau以及细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)基因过表达是引起卵巢癌细胞对紫杉醇耐药的主要原因。

总之，成功建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的基础上，多药耐药相关蛋白MRP1、微管相关蛋白MAP-Tau以及细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)基因过表达与卵巢癌细胞对紫杉醇耐药有关。

[1] Shen Y,Zhang XY,Chen X,et al.Synthetic Paclitaxel-octreotide Conjugate Reverses the Resistance of Paclitaxel in A2780/Taxol Ovarian Cancer Cell line[J].Oncol Rep,2017,37(1):219-226.

[2] Chen X,Zhang XY,Shen Y,et al.Synthetic Paclitaxel-octreotide Conjugate Reversing the Resistance of A2780/Taxol to Paclitaxel in Xenografted Tumor in Nude Mice[J].Oncotarget,2016,7(50):83451-83461.

[3] Liu Q, Sui R,Li R,et al.Biological Characteristics of Taxolresistant Ovarian Cancer Cells and Reversal of Taxol Resistance by Adenovirus Expressing[J].Mol Med Rep,2015,11(2):1292-1297.

[4] Busschots S,O'Toole S,O'Leary JJ,et al.Carboplatin and Taxol Resistance Develops More Rapidly in Functional BRCA1 Compared to Dysfunctional BRCA1 Ovarian Cancer Cells[J].Exp Cell Res,2015,336(1):1-14.

[5] Lee C.Overexpression of Tyro3 Receptor Tyrosine Kinase Leads to the Acquisition of Taxol Resistance in Ovarian Cancer Cells[J].Mol Med Rep,2015,12(1):1485-1492.

[6] Kim NY,Lee HY,Lee C.Metformin Targets Axl and Tyro3 Receptor Tyrosine Kinases to Inhibit Cell Proliferation and Overcome Chemoresistance in Ovarian Cancer Cells[J].Int J Oncol,2015,47(1):353-360.

[7] Li Y,Chen K,Li L,et al.Overexpression of SOX2 is Involved in Paclitaxel Resistance of Ovarian Cancer Via the PI3K/Akt Pathway[J].Tumour Biol,2015,36(12):9823-9828.

[8] Zou D,Wang D,Li R,et al.MiR-197 Induces Taxol Resistance in Human Ovarian Cancer Cells by Regulating NLK[J]. Tumour Biol,2015,36(9):6725-6732.

本文编辑：周文超

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1671-0126(2017)05-0004-04

石动菊，女，主治医师，从事妇产科临床工作