黄芪总苷和人参皂苷降低缺血性脑卒中患者脑脊液中谷氨酸、磷酸化Tau

杜杰

(咸宁市中心医院 湖北科技学院附属第一医院 神经内科，湖北 咸宁 437100)

·论著·

黄芪总苷和人参皂苷降低缺血性脑卒中患者脑脊液中谷氨酸、磷酸化Tau

杜杰

(咸宁市中心医院 湖北科技学院附属第一医院 神经内科，湖北 咸宁 437100)

目的通过观察黄芪总苷和人参皂苷对缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激后老年受试者谷氨酸浓度和Tau超磷酸化的影响，探讨两者对Tau超磷酸化的调节，并比较其作用途径，以期为改善缺血性脑卒中诱发的认知障碍的机制提供研究思路。方法采用2×3析因设计：即缺血性脑卒中(无卒中、缺血性脑卒中)和药物(静脉注射生理盐水、人参皂苷、黄芪总苷)的所有组合。干预后取脑脊液，HPLC测Glu含量，Western- blotting测p- AT8Ser202和GSK- 3β1H8含量。结果缺血性脑卒中可增加脑脊液内谷氨酸的浓度(P<0.05)；黄芪总苷可降低缺血性脑卒中诱发的过度升高的谷氨酸浓度，且两者有相减效果(P<0.05)；而人参皂苷对脑脊液中谷氨酸的浓度无明显影响(P>0.05)。缺血性脑卒中可增加脑脊液内p- AT8Ser202以及促进Tau超磷酸化的调控蛋白GSK- 3β1H8的表达(P<0.05)；黄芪总苷和人参皂苷可减缓脑脊液内p- AT8Ser202及促进其磷酸化的GSK- 3β1H8表达上调(P<0.05)；两者效果相似且和缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激的影响呈相减效果(P<0.05)。结论黄芪总苷和人参皂苷可降低缺血性脑卒中患者脑脊液中谷氨酸及磷酸化Tau浓度，缓解缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激。

黄芪总苷； 人参皂苷； N- 甲基- D- 天冬氨酸受体； Tau； 缺血性脑卒中

缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激可以造成脑脊液内谷氨酸浓度的过度升高，而且该过程具有显著的时效性和量效性。黄芪总苷作为天然的谷氨酸受体拮抗剂，其是否可以阻止“缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激诱发脑脊液内谷氨酸浓度的过度升高”该过程？故而，本研究探讨人参皂苷及黄芪总苷对缺血性脑卒中诱发的老年受试者认知状况和Tau的磷酸化的影响，分析其机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

筛选本院2013年1月至 2015年6月罹患缺血性脑卒中的老年受试者。入组标准：年龄65岁至80岁的老年受试者，平均年龄(69.68±9.54)；性别不拘，缺血性脑卒中受试者；ASA分级为Ⅰ或者Ⅱ级。排除标准：恶性肿瘤受试者；肝肾功能不全疾者；精神病患者。医学伦理学问题：受试者及家属签署同意参与研究的同意书(包括同意人体静脉注射用药)；依据临床指南的相关原则充分保障受试者的治疗安全；对患者诊疗记录进行保密，保护受试者的隐私权。本研究共筛选缺血性脑卒中老年受试者24例(男性12例、女性12例)和健康老年受试者24例(男性12例、女性12例)。

1.2 方法

1.2.1 研究对象分组和干预[1- 4]通过随机数字发生器将受试者随机分为6个试验组(n=8)：S组，即空白对照组(2 ml 生理盐水iv)、M组，即人参皂苷组(2 ml人参皂苷 5 mg·kg-1iv)、D组，即黄芪总苷组(5 ml黄芪总苷40 mg·kg-1iv)、SE组，即缺血性脑卒中组(缺血性脑卒中受试者； 2 ml 生理盐水iv)、ME组，缺血性脑卒中实施人参皂苷治疗组(缺血性脑卒中受试者；2 ml 人参皂苷5 mg·kg-1iv)、DE组，即缺血性脑卒中实施黄芪总苷治疗组(缺血性脑卒中受试者；5 ml黄芪总苷40 mg·kg-1iv)。

1.2.2 取材 治疗72 h后缓慢抽取取受试者脑脊液2 ml，进行15 min的离心处理(注：转速设定为12000 rpm，有效离心半径为 15 cm)。脑脊液进行称重，然后使用锡箔纸来进行标记和包裹，标本放置在液氮罐之中，经过12 h之后将标本转移至- 80 ℃保存。

1.2.3 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测Glu含量[5]。 配制浓度分别为0.15、0.30、0.735、1.47、2.94、3.675、5.88 mg/l的Glu溶液。应用外标法进行定量分析，得到Glu标准曲线方程。血清4 ℃ 3000 r/min离心5 min，取24 μl 在进样瓶中加入衍生试剂12 μl、四硼酸钠缓冲液(pH 9.18)960 μl，混匀，梯度洗脱，测Glu 含量。

1.2.4 Western- blotting法检测p- AT8Ser202(Ser202位点过磷酸化的Tau)、糖原合成酶激酶- 3β1H8(Glycogen synthase kinase- 3β1H8，GSK- 3β1H8)蛋白在受试老年受试者脑脊液内的含量[6](1)目标蛋白的提取：取受试老年受试者的脑脊液200 mg，加Western裂解液10 ml·mg-1，匀浆、破碎、冰浴、离心，提蛋白。(2)目标蛋白的定量：测定蛋白浓度，调其浓度一致。(3)凝胶电泳的实施：标本15μl上样， GAPDH为标定，电泳。(4)湿法转膜的实施：转膜，封闭，漂洗。(5)发光显影的实施：使用ECL试剂盒进行目标蛋白的印记显影。在检测前夕再配制适量ECL化学发光试剂盒A液和B液，在20 ℃环境之中放置以备使用。使用二抗进行孵育并且进行多次洗涤之后，再使用平头镊把膜取出，继而使用吸水纸吸去多余的液体(注意不要接触到膜有蛋白的一面)，继而显影定影和图像分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 HPLC法检测谷氨酸在受试者的脑脊液内的含量

受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激上调谷氨酸浓度(F=265.564,P=0.000)，黄芪总苷下调谷氨酸浓度(F=20.435,P=0.000)，老年受试者缺血性脑卒中和黄芪总苷存在显著的交互效应(F=12.494,P=0.000)(表1)。

组别谷氨酸含量(0.15g/gprot)S组7.29±1.15#⊕SE组25.21±4.75#⊕M组7.88±0.94#⊕ME组23.44±4.52#⊕D组6.24±0.99#⊕DE组14.22±2.36#⊕F值107.446P值0.000

注：#无卒中者和缺血性脑卒中者相比较，其差异有统计学意义，即P<0.001

注：⨁生理盐水、人参皂苷和黄芪总苷等处理措施间比较，其差异有统计学意义，即P<0.001

2.2 Western- blotting检测p- AT8Ser202、GSK- 3β1H8蛋白含量

受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激上调p- AT8Ser202和GSK- 3β1H8表达：(p- AT8Ser202：F=262.199,P=0.000)(GSK- 3β1H8：F=39.084,P=0.000)；而人参皂苷和黄芪总苷下调p- AT8Ser202和GSK- 3β1H8表达(p- AT8Ser202：F=69.384,P=0.000)(GSK- 3β1H8：F=69.941,P=0.000)；两因素存在交互效应(p- AT8Ser202：F=3.610,P=0.036)(GSK- 3β1H8：F=7.566,P=0.002)，即人参皂苷和黄芪总苷能够使得老年受试者缺血性脑卒中诱发脑脊液中磷酸化Tau的增加幅度减缓，其调控蛋白可能为GSK- 3β1H8。(图1；表2、3)

3 讨 论

Tau参与保持微管间的恰当距离，进而可影响神经元的轴突运输能力，其若发生过度磷酸化则能够使Tau的空间结构产生错误折叠，继而诱发学习和记忆等脑功能损害。老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激后出现脑功能损害与过高浓度的谷氨酸介导的神经元兴奋性毒性反应相关，因其可诱发氧化应激反应，造成神经元可塑性障碍；同时过高浓度的谷氨酸还能引发去极化，导致神经元凋亡甚至死亡。

谷氨酸是重要的神经元兴奋性递质，其是学习和记忆等脑功能所必备的前提条件，但若谷氨酸过多生成和释放，则其能够过度谷氨酸受体，继而引发谷氨酸介导的神经元兴奋性毒性反应。本试验发现老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激后脑脊液内的谷氨酸浓度显著上调，同时伴有认知状况下降。本研究发现，使用谷氨酸受体的拮抗剂之后，可以显著缓解谷氨酸介导的神经元毒性反应所诱发的学习记忆障碍，该发现结果与以往试验相似。

图1p-AT8Ser202和p-GSK-3β1H8蛋白在老年受试者脑脊液中的含量(WB)

组别p-AT8Ser199/202蛋白含量(WB,吸光度值)S组649.13±107.68#⊕SE组1291.88±136.46#⊕M组341.50±66.78#⊕ME组808.13±121.07#⊕D组336.25±57.56#⊕DE组789.25±147.75#⊕F值101.112P值0.000

注：#无卒中者和缺血性脑卒中者相比较，其差异有统计学意义，即P<0.001

注：⨁生理盐水、人参皂苷和黄芪总苷等处理措施间比较，其差异有统计学意义，即P<0.001

组别GSK-3β1H8蛋白含量(WB,吸光度值)S组454.88±104.69#⊕SE组674.50±77.24#⊕M组298.88±54.61#⊕ME组365.88±30.82#⊕D组296.25±54.37#⊕DE组360.13±36.51#⊕F值22.800P值0.000

注：#无卒中者和缺血性脑卒中者相比较，其差异有统计学意义，即P<0.001

注：⨁生理盐水、人参皂苷和黄芪总苷等处理措施间比较，其差异有统计学意义，即P<0.001

黄芪总苷和人参皂苷能够缓解老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激导致的学习和记忆等脑功能损害，机制与减弱兴奋毒性具有密切关系，推测其机制如下：①黄芪总苷和人参皂苷抑制谷氨酸合成。②黄芪总苷和人参皂苷抑制谷氨酸释放：ⅰ黄芪总苷和人参皂苷能够抑制钠通道，继而降低应激导致的神经元细胞膜的去极化状态，最终使得脑脊液内谷氨酸的释放量显著减少；ⅱ黄芪总苷和人参皂苷能够抑制一氧化氮合酶的活性，从而抑制脑脊液内谷氨酸的释放。③黄芪总苷和人参皂苷能够保护Na+/H+交换体活性，继而谷氨酸的转运速率。

认知状况异常与Tau的磷酸化程度相关[7- 10]，即Tau磷酸化愈高则认知状况越差。推测其分子机制，Tau发生变性(如其空间结构发生错误折叠)时，Tau失去其微管结合能力，造成神经元轴突运输障碍。受试老年受试者脑脊液内的总Tau在老年受试者缺血性脑卒中应激干预的前后没有显著变化，在诸磷酸化位点之中，pAT8Ser202位点的磷酸化与老年受试者缺血性脑卒中应激干预的关系紧密。研究者分析其原因，这一现象应与Ser202位点位于Tau的微管结合区有密切关系，因这一位点与Tau和微管的结合活性关系密切。糖原合成酶激酶- 3 (glycogen synthase kinase- 3，GSK- 3β)蛋白是最强的Tau磷酸化激酶(phosphorylating kinase)[11- 16]，催化Tau诸多位点发生磷酸化反应[17- 20]。本研究结果显示，老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激后受试新生老年受试者脑脊液内的谷氨酸的浓度显著升高，而且脑脊液内的磷酸化Tau蛋白(p- AT8Ser202)的含量亦明显上调，即老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激可诱发明显的神经元损伤[21, 22]。本研究发现Tau磷酸化程度的关键调控蛋白GSK- 3β1H8在老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激后与磷酸化Tau(p- AT8Ser202)同时上调，而且在黄芪总苷和谷氨酸受体的拮抗剂作用下与磷酸化Tau(p- AT8Ser202)同时回调。

本研究揭示，黄芪总苷和人参皂苷能够降低老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激后脑脊液内过度升高的谷氨酸浓度，而且能够使调节Tau磷酸化程度的关键蛋白GSK- 3β1H8表达降低，继而缓解Tau的过度磷酸化程度，最终改善老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激后的受试对象的认知状况。据此，研究者推测黄芪总苷和人参皂苷能够从以下方面中断老年受试者缺血性脑卒中诱发的缺血缺氧强应激导致的Tau超磷酸化进程：黄芪总苷和人参皂苷既能够降低脑脊液内谷氨酸的浓度，同时也能够抑制调节Tau磷酸化程度的关键蛋白GSK- 3β的表达。

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AcomparativestudyoftheeffectoftotalsaponinsofAstragalusandPanaxginsengsaponinsontheimprovementofcognitiveimpairmentinelderlypatientswithischemicstroke

DuJie

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofHubeiScienceandTechnologyInstitute,XianningCentralHospital,Xianning437100,China)

Objective: To observe Astragalosides and N- methyl - D- aspartate receptor antagonists on the concentration of glutamate and the ultra phosphorylation of Tau in elderly subjects with ischemic stroke induced by ischemia and hypoxia stress and the regulation of phosphorylation of Tau, in order to improve the understanding ofthe mechanism of cognitive impairment induced by ischemic stroke.Methods2*3 factorial design was used in the design of ischemic stroke (2 levels: no stroke, ischemic stroke) and drugs (3 levels of normal saline, ginsenoside and Astragalus). After the intervention, the cerebrospinal fluid, HPLC and Glu were measured, and the contents of p- AT8Ser202 and GSK- 3 were measured by Western- blot. The content of 1H8 and were measured.ResultsIschemic stroke increased the concentration of glutamic acid in the cerebrospinal fluid (P<0.05). Astragalosides reduced ischemic stroke induced by excessive increase of glutamic acid concentration, and the effect of subtraction (P<0.05). While the concentration of ginsenoside did not significantly affect on the CSF glutamate (P<0.05). The expression of ischemic stroke could increased in the cerebrospinal fluid of p- AT8Ser202 and promote Tau phosphorylation in the regulation of protein GSK- 3 β1H8(P<0.05). Astragaloside and ginsenoside could reduce cerebrospinal fluid p- AT8Ser202 and promote GSK- 3 β1H8phosphorylation (P<0.05). Both effects were similar, and the effects of ischemia hypoxia and stress on ischemic stroke were subtracted (P<0.05).ConclusionTotal saponins of Astragalus and Panax ginseng saponins can improve the cognitive impairment in elderly patients with ischemic stroke by decreasing the concentration of glutamic acid and slowing down the Tau phosphorylation. Thus, it can alleviate the ischemic hypoxia and stress caused by ischemic stroke.

total saponins of astragalus; ginsenoside; N- methyl - D- aspartate receptor; Tau protein; ischemic stroke

2017- 04- 06

2017- 09- 06

杜杰(1981-)，男，湖北汉川人，硕士研究生，主治医师，主要研究方向：缺血性脑血管病介入方向。E- mail:dujiee@126.com

杜杰. 黄芪总苷和人参皂苷降低缺血性脑卒中患者脑脊液中谷氨酸、磷酸化Tau[J].东南大学学报：医学版，2017，36(5):828- 832.

R151

A

1671- 6264(2017)05- 0828- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.029

(本文编辑：孙茂民)