流感丸中乌头碱含量测定研究

张有新，仇朝红，刘学良

（1.青海省互助县人民医院，青海 海东 810500；2.青海省药品不良反应监测中心，青海 西宁 810000；3.青海省食品药品审评中心，青海 西宁 810007）

流感丸中乌头碱含量测定研究

张有新1，仇朝红2，刘学良3

（1.青海省互助县人民医院，青海 海东 810500；2.青海省药品不良反应监测中心，青海 西宁 810000；3.青海省食品药品审评中心，青海 西宁 810007）

目的建立测定流感丸中乌头碱含量测定的高效液项色谱（HPLC）法。方法采用Hypersil-ODS C18柱色谱柱，以乙腈-四氢呋喃为流动相A，0.1 mol/L醋酸铵溶液为流动相B，（A:B）比例为（15:85）为；柱温为30℃；检测波长为240 nm。理论板数按乌头碱峰计算应不低于3000。结果在上述条件下，对乌头碱测定峰没有干扰，在0.1034 μg～1.2051 μg范围内与色谱峰面积之间线性关系良好。结论本方法准快速、简便、准确，可用于流感丸中乌头碱含量的HPLC测定。

流感丸；乌头碱；HPLC；

流感丸中草乌具有温经止痛和祛风除湿的功效，常用于心腹冷痛、风寒湿痹等疾病治疗。流感丸中草乌的主要成分为乌头碱及次乌头碱等，这些成分既是有效成分也是毒性成分。榜嘎通常以全草入药，乌头则多以块根或根入药[1]。榜嘎性凉、味苦，是藏医常用药物，具清热解毒的功效，在各种藏药复方制剂中较为常用。

1 仪器及试药

本研究所使用仪器为电子天平、高效液相色谱仪、紫外检测器、超声波清洗器乙腈、甲醇、四氢呋喃均为色谱纯。乌头碱（批号：110720-201111，含量按98.8%计）、新乌头碱（批号：110799-201106，含量按98.5%计）、次乌头碱（批号：110798-200805，含量按99.5%计）对照品。

2 方法与结果

2.1 测定波长的选择

根据二极管阵列检测器得到的紫外吸收光谱图及最大吸收波长显示，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的最大吸收波长为240 nm。

2.2 色谱条件与系统适用性试验考察：

流动相A和B分别为乙腈-四氢呋喃（25:15）和0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），（A:B）比例为（15:85）作为流动相；检测波长为240 nm，流速1.0 mL/分钟，填充剂使用十八烷基硅烷键合硅胶。

应用Hypersil-ODS C18柱与Sunfire C18柱（250 mm×4.6 mm），对以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾-醋酸-异丙醇（27:69:2:2）、甲醇-0.3 mol/L三乙胺（65:35）、以乙腈-四氢呋喃（25:15）为流动相A，0.1 mol/L醋酸铵溶液为流动相B，（A:B）比例为（15:85）为流动相时的分离情况进行考察，柱温为30℃，（A:B）比例为（15:85）为流动相，按乌头碱峰计算理论板数应在3000以上。

2.3 制备对照品溶液

乌头碱对照品准确称取12.11 mg、新乌头碱对照品8.79 mg、次乌头碱对照品10.33 mg，将异丙醇-三氯甲烷混合溶液加入到10mL容量瓶中，稀释后获得每1 mL含乌头碱1.1965 mg、新乌头碱0.8658 mg、次乌头碱1.0278 mg的溶液。精密量取上述三种溶液各1 mL，并在容量瓶中加入异丙醇-三氯甲烷混合溶液，待其稀释后获得含乌头碱0.11965 mg/mL、新乌头碱0.08658 mg/mL、次乌头碱0.10278 mg/mL的溶液。再精密量取上述稀释后溶液至10 mL容量瓶中，按1:1比例加入加异丙醇-三氯甲烷混合溶液，稀释后得含乌头碱11.965 μg、新乌头碱8.658 μg、次乌头碱10.278 μg每毫升的混合溶液。

2.4 制备供试品溶液

2.4.1 提取方法的考察

方法一（水提氯仿萃取法）取本品10 g，加水振荡后转移至离心管中，离心5分钟后取上清液，用0.04%HC1将沉淀洗2次，用10%氨水将pH值调为10，用氯仿萃取3次后，将10 mL的异丙醇-二氯甲烷（1:1）混合溶液加入到残渣中，取续滤液。

方法二（异丙醇-乙酸乙酯提取法）取10 g本品粉末，称定后将其置于具塞锥形瓶中，按1:1的比例加入异丙醇-乙酸乙酯混合液50 mL和5 mL氨试液，经超声处理30分钟后冷却，称定重量后补足减失的重量，摇匀滤过后在残渣中加入异丙醇-二氯甲烷混合溶液10 mL，经溶解滤过后取续滤液即可。

方法三（氨乙醚冷浸法）取本品粉末10 g，置于具塞锥形瓶中，加氨试液5 mL和乙醚50 mL，振荡5分钟，冷浸6小时，转移至50 mL离心管中，离心5分钟后取乙醚液，并在残渣中加10 mL甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。

方法四（氨乙醚超声法）取10 g粉末置于具塞锥形瓶中，精密加5 mL氨试液和50 mL乙醚，经超声处理半小时后转移至离心管中，离心5分钟后取乙醚液，加甲醇10 mL对残渣进行溶解，滤过后取续滤液，即得。

方法五（酸提氯仿萃取法）取本品粉末约15 g，置于具塞锥形瓶中，加50 mLHC1溶液，振荡6小时，转移至50 mL离心管中，离心5 min，获取上清液后用0.04%HC1洗沉淀2次，用氨水将pH值调为10，加氯仿萃取3次，在残渣中加入异丙醇-二氯甲烷混合溶液后取续滤液。

测定上述5种提取方法所得样品的含量，各种提取方法的提取率顺序为：方法三＞方法四＞方法二＞方法五＞方法一。确定方法三（氨乙醚冷浸法）为最有效的提取方法。

2.4.2 提取时间的考察

取本品10g，加氨试液5 mL，加乙醚50 mL，振荡5分钟，冷浸4、6、8小时，转移至50 mL离心管中，离心5 min后取乙醚液，用乙醚洗2次沉淀后合并乙醚液，蒸干。加甲醇2mL溶解残渣，滤过，取续滤液，即得。按照“2.2项”方法测定三种生物碱总含量。6、8小时所测得的三种生物碱总含量接近，以6小时为提取时间。

2.5 制备阴性对照溶液

取除榜嘎、草乌外的其余药味，制成不含榜嘎、草乌的制剂，制备阴性对照溶液。测定发现供试品溶液在对照品溶液出峰位置上无峰出现，说明对其无干扰。

2.6 样品测定结果

本研究中，3批样品的含量测定结果见表1。

表1 3批样品含测结果（n，%）

3 讨 论

稀盐酸和氨乙醚提取法是提取乌头类生物碱较为有效的方法，乌头类生物碱难溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂，在服用乌头属中药时，常用水煎煮法[2]，所以本实验对以氯仿、乙醚为溶剂的提取方法进行了对比。

乌头类生物碱在水中无法全部被溶出，溶解度低，所以水提取氯仿萃取法与其他方法相比提取率较低[3]。氨乙醚冷浸法则具有较高的提取率，其主要原因在于碱性环境下，乌头类生物碱能充分溶于有机溶剂并被萃取出来，其他方法的提取率均低于氨乙醚冷浸法[4]。

经测定发现，三批流感丸中的新乌头碱、乌头碱、次乌头碱含量在3.6547 μg/g～3.9215 μg/g之间，取样量低于5 g时，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱三个峰低于定量限，取样量超过15 g后样品中杂质干扰较大，不利于检测，故在试验中取样量定为10 g[5]。流感丸标示重量为0.25 g，用法用量为：一次4～8丸，一日2～3次，按日最高服用剂量（一次8丸，一日3次，流感丸中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的总量以4 μg/g计）来计算，日服乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的总量为24 μg，有必要采用高效液相色谱法对其进行乌头碱限量控制。

[1] 杨秀芳,王 峰.含乌头碱类药物致不良反应的特点及规律,中外健康文摘2013,10(21):371-372.

[2] 刘高宏,魏立莉.流感丸中乌头碱的限量检查及HPLC含量测定方法的建立[J].西部中医药,2016,29(11):24-26.

[3] 吴成凤,李国卫,王樟根.LC-MS/MS法同时测定乌头汤中乌头碱型生物碱含量[J].中药新药与临床药理,2015(6):833-837.

[4] 袁 帅,许 玉,黄 磊.乌头属药材中单酯型乌头碱的ELISA法测定[J].中国医药工业杂志,2016,47(7):897-901.

[5] 魏文芝,海 平,骆桂法.超高效液相色谱—质谱联用法测定藏药萨热十三味鹏鸟丸中乌头碱类含量[J].中国药业,2016,25(18):25-29.

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ISSN.2095-8242.2017.38.7497.02

本文编辑：王雨辰