一种不动杆菌/鲍曼不动杆菌快速鉴定方法

●陈浩宁

一种不动杆菌/鲍曼不动杆菌快速鉴定方法

●陈浩宁

鲍曼不动杆菌是目前临床最常见的多重耐药菌，但现有全自动细菌鉴定仪无法将鲍曼不动杆菌从不动杆菌中鉴别出来。本研究基于鲍曼不动杆菌特异性ITS序列和不动杆菌高度保守rA序列建立多重PCR技术，可以有效地从不动杆菌中筛选出鲍曼不动杆菌，该方法在细菌耐药机制和医院内感染的流行病学研究中具有重要使用价值。

不动杆菌;鲍曼不动杆菌;PCR

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是不动杆菌属中最重要的一个临床分离病原菌，占临床分离不动杆菌的80%～90%[1]。与此同时，不动杆菌属中数个种与鲍曼不动杆菌生化反应非常相似，目前临床自全动细菌鉴定仪无法有效区分，故只能统一称为醋酸钙—鲍曼复合不动杆菌[2]。目前临床感染主要以鲍曼不动杆菌为主，其耐药性也最显著，其他不动杆菌在流行病学和耐药机制与鲍曼不动杆菌存在较明显差异[3]。因此有必要建立一种快速简便的技术，准确鉴定鲍曼不动杆菌，为医院内感染防治提供指导。

1 材料和方法

1.1 菌株

随机选取本院分离醋酸钙—鲍曼复合不动杆菌40株，置于35℃培养箱中培养16h用于后续实验。

1.2 细菌DNA模板制备

使用陈方圆等[4]报道煮沸法制备模板：挑取单个菌落，与100μl灭菌双蒸水中混匀，煮沸10min后离心10 min，吸取上清即为模板。

1.3 引物合成

根据鲍曼不动杆菌ITS序列和不动杆菌rA序列设计多重PCR引物。鲍曼不动杆菌ITS基因扩增引物为Ab-ITSF：5’-CATTATCACGGTAATTAGTG-3’ 和 Ab-ITS-R：5’-AGAGCACTGTGCACTTAAG-3’，预测扩增产物长度为208bp。不动杆菌rA基因扩增引物为rA-F：5’-CCTGAATCTTCTGGTAAAAC-3’和rA-R：5’-GTTTCTGGGCTGCCAAA CATTAC-3’，预测扩增产物长度为425bp。引物交由苏州泓迅生物技术公司合成。

1.4 PCR扩增

在PCR反应管中依次加入如下成份：PCR预混液(南京Vazyme公司)12.5μl，上下游引物各0.5μl，模板2μl，最终加灭菌双蒸水至25μl。PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，重复循环35次，最终72℃延伸10 min。扩增产物通过1%浓度琼脂糖电泳分析结果。

2 结果

经1%浓度琼脂糖电泳后，40株醋酸钙—鲍曼复合不动杆菌均扩增出425 bp不动杆菌rA条带，其中4株未扩增出208 bp鲍曼不动杆菌ITS条带，其他各株均扩增出该条带(见图1)。结果表明，该4株菌不是鲍曼不动杆菌，全自动细菌鉴定仪所鉴定的醋酸钙—鲍曼复合不动杆菌中有10%菌为其他不动杆菌，而非鲍曼不动杆菌。

图1 PCR扩增结果 M：标准DNA分子量标记

3 讨论

不动杆菌属目前至少包含有33种基因型，其中醋酸钙不动杆菌、鲍曼不动杆菌、不动杆菌菌属3型以及不动杆菌菌属13TU的基因型和表型高度的相似性，无法采用常规方法鉴别。目前临床感染的不动杆菌中，以鲍曼不动杆菌的耐药性增强最为迅速，对患者的威胁最大[5]。同时不同种不动杆菌的流行病学仍有较大差异，其耐药性的获得机制也存在差异，因此有必要进一步对临床检出的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体做进一步鉴别，为鲍曼不动杆菌耐药机制研究提供合格的研究样本[6]。本研究中建立多重PCR法操作简便，可以迅速完成对临床标本的鉴定工作，在鲍曼不动杆菌流行病学研究和医院内感染研究中具有重要作用。

(作者单位：江苏大学附属医院检验科)

[1]罗兰.陆坚.马翠萍.聂晓英.廖康.耐亚胺培南鲍曼不动杆菌医院内感染流行的分子机制研究.中国微生态学杂志2004,16(4)：218-220.

[2]芮晓艳.胡杰贵.熊自忠.耐亚胺培南鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶检测及同源性分析.安徽医科大学学报2012,47(2)：154-157.

[3]李永丽.应春妹.陈艺升.ERIC-PCR技术在鲍曼不动杆菌基因分型中的应用评估.检验医学2013,28(7)：621-624.

[4]陈方圆.马笑雪.蔡景钰.王斯.罗恩杰.多重耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)的临床药物治疗及耐药机制研究.微生物学杂志2010,30(1)：71-74.

[5]PaganoM,Martins AF, Machado AB, Barin J, Barth AL.Carbapenem-susceptible Acinetobacter baumannii carrying the ISAba1 upstream blaOXA-51-like gene in Porto Alegre, southern Brazil. Epidemiology and infection 2013, 141(2)：330-333.

[6]Ma Z, Zhou L, Wang H, Luo L.Investigation on the genomic diversity of OXA from isolated Acinetobacter baumannii. International journal of clinical and experimental medicine 2015, 8(3)：4429-4432.

陈浩宁(1987～)，男，初级检验师，硕士，研究方向为临床检验诊断学。