头穴透刺对MCAO/R大鼠缺血脑组织NF-κB、TNF-α蛋白表达的影响*

吴明娟，孙晓伟，卢金荣，沙丽丽，张 雪，赵 岩，李 锐，程康陆，万 琎

(1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江哈尔滨150036;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040;3.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

头穴透刺对MCAO/R大鼠缺血脑组织NF-κB、TNF-α蛋白表达的影响*

吴明娟1，孙晓伟2△，卢金荣3，沙丽丽1，张 雪1，赵 岩1，李 锐1，程康陆1，万 琎1

(1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江哈尔滨150036;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040;3.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

目的:探讨头穴透刺对脑缺血再灌注大鼠核转录因子 -κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)表达的影响。方法:70只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和头针组。线栓大鼠右侧大脑中动脉制备局灶性大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)动物模型。头针组大鼠采用透刺法针刺右侧百会、曲鬓穴。神经功能评分检测各组大鼠不同时间点神经功能缺损程度;免疫组化法检测缺血脑组织NF-κB、TNF-α蛋白的定性表达情况;Western blot和ELISA法分别检测缺血脑组织NF-κB、TNF-α蛋白的定量表达情况。结果:头针组大鼠神经功能缺损程度较模型组减轻，再灌注3天、7天，mNSS评分与同期模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。模型组和头针组大鼠不同时间点缺血脑组织中NF-κB、TNF-α蛋白含量均较假手术组明显升高(P＜0.05);但头针组大鼠缺血脑组织中NF-κB、TNF-α蛋白含量均较同时间点模型组明显降低(P＜0.05)。结论:头穴透刺可明显改善脑缺血再灌注后大鼠的神经功能缺损，具有神经保护作用，其机制可能与抑制脑缺血再灌注后缺血脑组织中NF-κB、TNF-α蛋白表达、降低缺血再灌注后的炎症反应有关。

头穴透刺;百会;曲鬓;脑缺血再灌注损伤;核转录因子-κB;肿瘤坏死因子-α

脑缺血再灌注损伤(CIRI)是一个较为复杂的过程，包括脑组织异常代谢、能量供应障碍、自由基生成、脑组织炎性反应等多个环节。其中脑组织炎症级联反应是脑缺血再灌注损伤发生的重要机制之一。近年来研究发现，NF-κB信号通路与炎症级联反应的发生密切相关［1］。因此，本研究以此为切入点，通过复制大鼠右侧大脑中动脉缺血2 h再灌注模型，旨在观察头穴透刺对大鼠脑缺血再灌注后炎症级联反应过程中发挥重要作用的NF-κB、TNF-α蛋白表达的影响，从而探讨头穴透刺对脑缺血再灌注损伤的可能神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

取清洁级雄性 SD大鼠70只，体质量(250±30)g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物许可证:SCXK(黑)2013-0027，随机分成3组，分别为假手术组(10只)、模型组(30只)和头针组(30只)。模型组与头针组再根据缺血2 h再灌注后的时间不同分为3个亚组(再灌注后1天、再灌注后3天、再灌注后7 天:IR1 d、IR3 d、IR7 d)，每个亚组10 只大鼠。

1.2 模型的建立

模型组与头针组采用改良的 Zea Longa线栓法［2］，制备大鼠右侧大脑中动脉缺血2 h再灌注模型(栓塞2 h后拔出栓子，恢复血流供应，实现再灌注);假手术组仅将线栓插入12 mm，并不中断大脑中动脉的血流。

1.3 各组干预方法

大鼠清醒后的头针组予以百会透曲鬓针刺治疗，穴位选择参考《实验动物穴位图谱》，取患侧百会穴及曲鬓穴，进针深度约为0.8寸，给予每分钟200转以上速度进行捻转，持续捻转5 min，每间隔5 min捻转1次，留针时间为30 min。为确保假手术组和模型组大鼠与头针组大鼠的饲养条件相同，两组大鼠每天也要在头针组治疗时间抓取并固定1次(30 min/次)。

1.4 行为学检测

各组大鼠采用mNSS评分［3］，在脑缺血2 h再灌注后1天、3天、7天进行神经功能缺损评分的测定，mNSS评分共18分，分值越高神经功能缺损程度越重。

1.5 免疫组化检测

各组5只大鼠在再灌注后相应时间点，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，主动脉依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛，断头取脑后，制成4 um的石蜡切片。将石蜡切片进行脱蜡，脱水，抗原修复，双氧水灭活内源性过氧化物酶，血清封闭内源性抗原，加入一抗(兔抗NF-κB 抗体1∶500、兔抗 TNF-α 抗体1∶500)4°孵育过夜，次日二抗孵育30 min，DAB显色，苏木素染核，酒精梯度透明，封片，镜检。

1.6 Western blot检测

各组5只大鼠在再灌注后相应时间点，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，断头取脑。将脑组织进行蛋白抽提，BCA法蛋白定量。根据NF-κB蛋白的分子量，配置12%和8%的分离胶，浓缩胶浓度为5%。NF-κB蛋白的上样量是每孔10 ug。SDS-PAGE电泳，湿转法电转，3%BSA-TBST中室温封闭30 min，一抗(兔抗NF-κB抗体1∶500)4°孵育过夜，二抗［羊抗兔IgG(H+L)HRP，1∶10000］，室温轻摇40 min。ECL 加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光，显影2 min，定影，胶片扫描。

1.7 ELISA 检测

各组大鼠在再灌注后相应时间点，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，于心尖搏动处抽取适量血液，室温静置30 min，离心取上清液，参照TNF-α ELISA试剂盒的说明书进行TNF-α蛋白含量的定量检测。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 不同时间点各组大鼠mNSS评分测定结果

假手术组大鼠没有表现出神经功能缺损。模型组和头针组大鼠在造模后均出现不同程度的神经功能缺损，与假手术组比较，均有统计学差异(P＜0.05)。模型组大鼠随着再灌注时间的延长，神经功能缺损有所恢复:其中再灌注1天，mNSS评分最高;再灌注3天，mNSS评分有所减低;至再灌注7天，mNSS评分持续降低。而头针组大鼠神经功能缺损程度均较模型组减轻，mNSS评分均较同期模型组降低，且随着针刺治疗次数的增多和治疗时间的延长，在再灌注3天、7天，mNSS评分与同期模型组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

表1 不同时间点各组大鼠mNSS评分比较(±s，分)

表1 不同时间点各组大鼠mNSS评分比较(±s，分)

注:与假手术组比较，☆P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d假手术组组别 例数10 0 0 0模型组 10 9.8 ±1.1☆ 8.9 ±1.2☆ 8.1 ±1.1☆头针组 10 9.5 ±1.0☆ 7.8 ±1.0☆△ 6.8 ±0.9☆△

2.2 不同时间点各组大鼠缺血侧脑组织NF-κB免疫组化染色结果

假手术组大鼠脑组织内仅见少量NF-κB阳性细胞表达。模型组NF-κB阳性细胞表达增加，主要表达于神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞的胞浆及胞膜中，其中再灌注3天表达增加最为明显。头针组也可见NF-κB阳性细胞表达，但各时间点较模型组表达均明显减少(P＜0.05)。见封三彩图1、表2。

表2 各组大鼠缺血侧脑组织NF-κB阳性细胞数比较(±s)

表2 各组大鼠缺血侧脑组织NF-κB阳性细胞数比较(±s)

注:与假手术组比较，☆P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d组别 例数假手术组5 25.77 ±1.25 25.38 ±0.79 26.06 ±1.12模型组 5 42.31 ±1.68☆ 64.38 ±1.62☆ 50.41 ±1.12☆头针组 5 38.34 ±0.68☆△52.52 ±1.72☆△ 35.85 ±1.61☆△

2.3 不同时间点各组大鼠缺血侧脑组织TNF-α免疫组化染色结果

假手术组大鼠脑组织内仅见少量TNF-α阳性细胞表达。模型组TNF-α阳性细胞表达增加，主要表达于神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞的胞浆及胞膜中，其中再灌注3天表达增加最为明显。头针组也可见TNF-α阳性细胞表达，但各时间点较模型组表达均明显减少(P＜0.05)。见封三彩图2、表3。

表3 各组大鼠缺血侧脑组织TNF-α阳性细胞数比较(±s)

表3 各组大鼠缺血侧脑组织TNF-α阳性细胞数比较(±s)

注:与假手术组比较，☆P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d假手术组组别 例数5 22.41 ±0.49 23.12 ±0.68 22.19 ±0.51模型组 5 39.67 ±1.13☆ 62.98 ±1.59☆ 53.65 ±1.98☆头针组 5 34.98 ±1.86☆△48.66 ±2.21☆△ 36.23 ±1.82☆△

2.4 不同时间点各组大鼠缺血侧脑组织NF-κB表达的Western blot检测结果

假手术组大鼠缺血侧脑组织中NF-κB蛋白含量较低，仅为0.41±0.001。模型组大鼠在再灌注1天，缺血侧脑组织中NF-κB蛋白含量即出现明显增加;至再灌注3天达高峰，随后含量有所减低，再灌注7 d时其含量降为0.79±0.003，但仍明显高于假手术组(P＜0.05)。而头针组大鼠在再灌注后各时间点缺血侧脑组织中NF-κB蛋白含量均较同期模型组明显降低(P ＜0.05)。见图3、表4。

图3 各组大鼠缺血侧脑组织NF-κB蛋白条带及相对含量比较

表4 各组大鼠缺血侧脑组织NF-κB表达相对蛋白含量比较(±s)

表4 各组大鼠缺血侧脑组织NF-κB表达相对蛋白含量比较(±s)

注:与假手术组比较，☆P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d假手术组组别 例数5 0.41 ±0.001 0.41 ±0.001 0.41 ±0.001模型组 5 0.66 ±0.005☆ 0.99 ±0.001☆ 0.79 ±0.003☆头针组 5 0.60 ±0.003☆△0.82 ±0.002☆△ 0.56 ±0.006☆△

2.5 不同时间点各组大鼠缺血侧脑组织TNF-α的ELISA检测结果

假手术组大鼠缺血侧脑组织中TNF-α蛋白含量较低，且不同时间点TNF-α蛋白含量无统计学差异(P＞0.05)。模型组大鼠在再灌注1天，缺血侧脑组织中TNF-α蛋白含量即出现明显增加;至再灌注3天达高峰，随后含量有所减低，再灌注7天时其含量降为4.06 ±0.29，但仍明显高于假手术组(P ＜0.05)。而头针组大鼠在再灌注后各时间点缺血侧脑组织中TNF-α蛋白含量均较同期模型组明显降低(P＜0.05)。见表 5。

表5 各组大鼠血清中TNF-α含量比较(±s，ng/L)

表5 各组大鼠血清中TNF-α含量比较(±s，ng/L)

注:与假手术组比较，☆P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d假手术组组别 例数10 2.41 ±0.43 2.44 ±0.21 2.41 ±0.19模型组 10 5.24±0.68☆ 6.78±0.71☆ 4.06±0.29☆头针组 10 3.93 ±0.55△☆ 5.08 ±0.18△☆ 2.99 ±0.65△☆

3 讨论

脑缺血再灌注损伤(CIRI)是指缺血的脑组织经血液再灌注后，脑组织的损伤较缺血前更加严重的现象［4］。脑缺血再灌注损伤的病理生理进程极其复杂，近年来研究发现，炎症级联反应是CIRI的重要机制之一。而NF-κB信号通路与炎症级联反应的发生最密切相关［5］。脑缺血再灌注后脑组织细胞受内毒素、氧自由基及炎症相关因子等多种因素刺激后，激活NF-κB信号通路，被激活的NF-κB从细胞质转至细胞核内［6］，进入细胞核内的 NF-κB能调控诸如 TNF-a、IL-1β等炎性细胞因子的基因表达，从而介导炎症级联反应发生［7］。因此，NF-κB是缺血再灌注损伤过程中的重要介质之一，早期阻断NF-κB的表达是防治脑缺血再灌注损伤的有效途径之一。

TNF-a是一种多效能的炎性细胞因子，人体正常情况下，血浆中仅有少量TNF-a表达，以助机体提高免疫能力，促进组织修复和愈合。脑缺血发生后早期即出现TNF-a表达增加，通过促进相关的黏附分子和趋化因子表达，一方面诱导损伤局部的炎性细胞浸润，引起局部的炎性反应，另一方面这些黏附分子和趋化因子反过来又可以激活NF-κB，从而使NF-κB活化在组织间不断扩散，进一步加重炎症反应［8］，加重CIRI。

本实验通过复制MCAO/R大鼠模型，应用免疫组化、Western blot和ELISA等检测方法，探讨头穴透刺对大鼠脑缺血再灌注后炎症级联反应过程中发挥重要作用的NF-κB、TNF-α蛋白表达的影响。结果发现:脑缺血再灌注后在缺血侧脑组织中存在明显的NF-κB、TNF-a阳性细胞反应性增多和蛋白表达上调，表明脑缺血、损伤及炎症等因素确实可激活NF-κB信号通路;上调的NF-κB、TNF-a可导致脑缺血再灌注损伤的发生和发展。而早期的百会透曲鬓头针干预能够降低脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损，对脑缺血再灌注损伤大鼠具有神经保护作用。同时早期的百会透曲鬓头针干预能够降低缺血侧脑组织中NF-κB、TNF-a阳性细胞数和蛋白表达，表明百会透曲鬓头针疗法可能是通过抑制NF-κB的激活、降低TNF-a的表达，减轻脑缺血再灌注后NF-κB信号通路激活导致的相关级联损伤。因此，笔者推测百会透曲鬓头针疗法可能通过抑制脑缺血再灌注后缺血脑组织中NF-κB、TNF-α蛋白表达，从而降低缺血再灌注后的炎症级联反应，继而发挥其神经保护的作用，为临床防治缺血性脑血管病提供了新的临床思路。

［1］田晔，万琪，王洪典.核因子κB在脑缺血及再灌注损伤炎症机制中的作用［J］.国外医学·脑血管疾病分册，2002，10(2):143

［2］孙晓伟，于学平，李洪涛，等.头针对脑缺血再灌注大鼠脑组织MMP-9表达调控的动态研究［J］.中医药学报，2011，39(3):107-109

［3］Chen J，Sanberg PR，Li Y，et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats［J］.Stroke，2001，32(11):2682-2688

［4］赵阵，傅敏，张陆弟.高压氧治疗脑缺血再灌注损伤的机制及进展［J］.中华航海医学与高气压医学杂志，2010(2):124-127

［5］Zhang S，Qi Y，Xu Y，et al.Protective effect of flavonoid-rich extract from Rosa laevigata Michx on cerebra is-chemia-reperfusion injury through suppression of apopto-sis and inflammation［J］.Neurochem Int，2013(4):S0197-0186

［6］Zhang X，Wang C.Neuroprotection of ear-ly and short-time applying berberine in the acute phase of cerebral ischemia:Up-regulated p Akt，p GSK andp CREB，down-regulated NF- κB expression ，ameliorated BBB permeability［J］.Brainresearch，2012，1459:61-70

［7］于凌志，左艳丽，贾孟辉，等.核转录因子 NF-KB对脑缺血再灌注干预机制的研究进展［J］.中国民族医药杂志，2015，7(7):42-44

［8］王冬梅，刘桂芝，王久敏，等.白细胞介素-23及核因子-k B在大鼠脑梗死模型中的表达［J］.现在中西医结合杂志，2013，22(2):139-141

Effect of GV20-GB7 Scalp-acupuncture on the Protein Expressions of NF-κB and TNF-α in MCAO/R Rats

WU Ming-juan1，SUN Xiao-wei2△，LU Jin-rong3，SHA Li-li1，ZHANG Xue1，ZHAO Yan1，LI Rui1，CHENG Kang-lu1，WAN Jin1
(1.Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Science，Harbin 150036，China;2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;3.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the effect of GV20-GB7 scalp-acupuncture on the expression of nuclear factor-κβ(NF-κβ)and tumor nerosis factor-α(TNF-α)in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.Methods:70 SD rats(male)were randomly divided into the sham group，the model group，and the scalpacupuncture group.The models were established by MACAO/R method.Therapy of needling GV20-GB7 at the trouble side was applied in the scalp-acupuncture group.Neurological function scores were used to measure the degree of neurological impairment at different time point in the groups.The qualitative and the quantitative protein expressions of NF-κB and TNF-a were detected by immunohistochemistry，Western blot and ELISA methods.Results:The degree of neurologic defect was alleviated significantly in the scalp-acupuncture group than that in the model group，and there was significant difference between the two groups in terms of mNSS score on 3rd and 7th day of the reperfusion(P ＜0.05).The contents of NF-κB and TNF-a were obviously increased in the model group and the scalp-acupuncture group，which were both higher than those in the sham operation group(P ＜0.05)，but they were much lower in the scalp-acupuncture group than those in thecontrol group at the same time point(P ＜0.05).Conclusion:GV20-GB7 scalp-acupuncture can obviously improve nerve function in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury，it has protective effect on nerve，which mechanism may be related to the inhibition of protein expressions of NF-κB and TNF-a and inflammation reduction.

Point-to-point scalp acupuncture;GV20;GB7;Cerebral ischemia/reperfusion injury;NF-κB;TNF-a

R246.6

A

1005-0779(2017)10-0064-04

黑龙江省自然科学基金，编号:H2016045;黑龙江省博士后资助项目，编号:LHB-Z12248。

吴明娟(1964-)，女，副主任医师，研究方向:针灸治疗神经系统疾病的临床与机理研究。

△通讯作者:孙晓伟(1979-)，女，副主任医师，硕士研究生导师，黑龙江中医药大学在站博士后研究人员，研究方向:针灸治疗神经及精神系统疾病的临床与机理研究。

2017-04-31