脂联素改善阿尔茨海默病模型小鼠焦虑情绪及工作记忆*

曲雪松， 石 辉,2， 曹秀丽， 董雪帆， 李 甜， 焦娟娟， 祁金顺， 武美娜△

(1. 山西医科大学生理学系， 细胞生理学省部共建教育部重点实验室， 太原 030001；2. 内蒙古赤峰市医院重症医学科， 赤峰 024000)

脂联素改善阿尔茨海默病模型小鼠焦虑情绪及工作记忆*

曲雪松1， 石 辉1,2， 曹秀丽1， 董雪帆1， 李 甜1， 焦娟娟1， 祁金顺1， 武美娜1△

(1. 山西医科大学生理学系， 细胞生理学省部共建教育部重点实验室， 太原 030001；2. 内蒙古赤峰市医院重症医学科， 赤峰 024000)

目的探讨脂联素(APN)预处理对9月龄三转基因阿尔茨海默病(3xTg-AD)模型小鼠学习记忆能力和焦虑情绪的影响。方法选取9月龄3xTg-AD小鼠及C57BL/6J小鼠，分为4组：WT+Saline组、3xTg-AD +Saline组、WT+APN组和3xTg-AD +APN组，每组8只。将全部小鼠进行侧脑室埋管术后，恢复7 d，在自由清醒状态下分别经侧脑室给予生理盐水或APN，采用旷场、新物体识别及Y-迷宫3种行为学手段检测小鼠的情绪及学习记忆能力。结果①在旷场实验中，与WT+Saline组小鼠相比，3xTg-AD +Saline组小鼠在中央区域的活动时间明显缩短，在外周区域的活动时间明显延长，给予APN后可有效逆转3xTg-AD小鼠的该现象，表明脂联素可有效缓解3xTg-AD小鼠的焦虑情绪。②新物体识别实验中，3xTg-AD+Saline组小鼠的辨别指数为(-16.7±10.1)%，明显低于WT+Saline组的(18.0±8.2)%(P<0.01)和3xTg-AD +APN组的(15.7±8.8)%(P<0.01)，表明脂联素可明显改善3xTg-AD小鼠的识别记忆能力损伤。③Y-迷宫实验中，3xTg-AD +Saline组小鼠的自发交替正确率为(40.0±1.7)%，明显低于WT+Saline组的(56.6±4.6)%(P<0.01)和3xTg-AD +APN组的(53.9±5.6)%(P<0.01)，表明脂联素能够逆转3xTg-AD小鼠工作记忆能力的损伤。结论脂联素可以改善9月龄3xTg-AD小鼠的焦虑情绪及识别记忆和工作记忆能力损伤，可能在AD的预防和治疗中发挥有效作用。

脂联素；阿尔茨海默病；三转基因小鼠；焦虑；学习记忆

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是1906年首次被报道的一种原发性神经系统退行性疾病。2015年阿尔茨海默病报告显示，目前全世界已有超过4 600万人受累于此病，其中2015年新发痴呆病例为990万，且该数字每20年会翻倍，可见AD已严重危害人类的健康[1]。AD的临床表现主要为认知功能障碍和学习记忆能力下降，同时伴有焦虑、抑郁等情绪方面的变化。AD的典型病理特征包括老年斑、神经原纤维缠结、神经元丢失和脑萎缩。老年斑的核心成分为β淀粉样蛋白(amyloid β protein, Aβ)，它由β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, β-APP)水解形成；神经原纤维缠结则由tau蛋白过度磷酸化导致。同时早老素(presenilin, PS)1和PS2基因在AD的发病过程中也起着重要作用。三转基因AD模型小鼠(triple-transgenic AD model, 3xTg-AD)同时包含有PS1M146V, APPSwe和TauP301L 3种基因的突变，不仅能够模拟AD患者的临床表现，而且能同时表现出老年斑和神经原纤维缠结两个典型的病理特征，是近年新建立的一种比较理想的AD动物模型[2]。

脂联素(adiponectin, APN)是1995年被首次报道的，一种来源于脂肪细胞的蛋白质激素。以往的研究发现，脂联素具有抗炎、增强胰岛素敏感性、促进脂肪酸分解代谢及影响葡萄糖转运等功能，与心血管疾病、2型糖尿病、肥胖等代谢类疾病密切相关[3]。近年研究发现，除在外周发挥作用，脂联素也与包括AD在内的中枢神经系统退行性疾病密切相关。Chan KH等人在细胞水平发现脂联素可以减少人类成神经细胞瘤细胞中Aβ的产生和沉积，对抗Aβ的神经毒性作用[4]。在原代培养的海马神经元中，脂联素可以对抗海人藻酸的兴奋毒性，减少KA引起的活性氧产生及Caspase-3的激活[5]。然而，目前对于脂联素神经保护作用的研究大多停留在离体水平，在体动物水平的研究甚少，对于脂联素在AD病程中对学习记忆能力损伤有何作用的研究更是少见。因此，本研究在假设脂联素对AD具有神经保护作用的基础上，外源性给予3xTg-AD小鼠脂联素，观察其对3xTg-AD小鼠焦虑情绪、识别记忆和工作记忆能力损伤的影响，希望为预防和治疗AD提供新的策略和思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3xTg-AD小鼠由美国Jackson实验室引进，并在山西医科大学实验动物中心饲养繁殖。野生型(wild type, WT)C57BL/6J小鼠为3xTg-AD小鼠的背景鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。所有小鼠均为雄性并且在清洁级条件下饲养，12/12 h光照黑暗交替，环境温度(22±2)℃，相对湿度为50%～60%，自由饮水，摄食。9月龄、体重在25～28 g之间的3xTg-AD和WT小鼠随机分为4组：WT+Saline组，3xTg-AD+Saline组，WT+APN组，3xTg-AD+APN组，每组8只，分别经侧脑室慢性给予脂联素或生理盐水。将小鼠称重后以0.03 ml/10 g水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上，根据脑立体定位图谱定位侧脑室的位置(前囟后0.6 mm,旁开1.1 mm)[6]，用颅骨钻钻孔并将套管插入，牙科水泥固定，术后小鼠恢复1周开始给药。脂联素(Pepro Tech, USA)用生理盐水溶解并配制为0.1 μg/4 μl的溶液，-20℃保存。在自由清醒状态下对小鼠每天经侧脑室注射0.1 μg/4 μl 的脂联素[7,8]或等体积的生理盐水，连续注射10 d，10 d后开始行为学实验，实验期间持续给药。

1.2 旷场实验

旷场实验箱的长宽高分别为55 cm×55 cm×30 cm，底面为一个正方形。将旷场平均分成25个小格,中间9个小格定义为中央区域，其余16个小格则为外周区域。实验箱正上方2 m处架有一红外摄像头，其视野可以覆盖整个旷场。实验前将动物放到行为学实验室适应24 h，实验应在安静环境中进行。实验开始时，将小鼠放到旷场的正中央，让其自由探索5 min。每只小鼠实验结束后，都要用酒精擦拭旷场，以消除气味对实验结果的影响。记录指标包括小鼠在旷场中的总运动距离、在中央区域的时间占总时间的百分比和在外周区域的时间占总时间的百分比。其中，旷场中的总运动距离可反映小鼠的运动能力，而通过计算小鼠在中央区域或外周区域的活动时间占总时间的百分比可反映小鼠的焦虑程度[9]。

1.3 新物体识别实验

在旷场中放入两个完全相同的物体，两物体间相距25 cm并与两侧壁均相距15 cm。首先进行熟悉阶段实验，将小鼠从非物体区域的中间贴壁放入旷场中自由活动10 min，旨在使其对测试环境中的物体进行熟悉。活动结束后将小鼠放回笼中休息5 h，然后进行测试阶段实验。将旷场中的一个物体换成相同材质，但形状和颜色不同的另一新物体，再将小鼠从同一位置放入，仍旧探索10 min，通过比较小鼠探索新物体和旧物体(熟悉阶段所见过的物体)的时间来评判小鼠的识别记忆能力。分析指标包括物体识别指数(recognition index, RI)和辨别指数(discrimination index, DI)，物体识别指数=探索新物体时间或探索旧物体时间/(探索新物体时间+探索旧物体时间)×100%，辨别指数=(探索新物体的时间-探索旧物体的时间)/(探索新物体时间+探索旧物体时间)×100 %[10]。

1.4 Y迷宫自发交替实验

Y迷宫由3个臂组成，各臂之间的夹角为120°，每个臂的长宽分别为30 cm×5 cm。实验开始时，将小鼠放入三臂交汇处，让其自由探索8 min，记录小鼠总进臂次数和进臂顺序并由此计算其自发交替的正确率。前两次的进臂顺序不计，从第3次开始计算，进入的臂与前两次不同则为正确，否则错误。自发交替正确率=正确进臂次数/(总进臂次数-2)×100 %[11]。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 脂联素可缓解3xTg-AD小鼠的情绪焦虑程度

旷场实验可以反映小鼠的运动能力和焦虑情绪。四组小鼠在旷场中的总运动距离如表1所示，WT+APN组的总运动距离明显高于WT+Saline组(P<0.05)，但3xTg-AD +Saline组和3xTg-AD +APN组的总运动距离与WT+Saline组相比均无统计学差异，表明安静状态下9月龄3xTg-AD小鼠的运动能力未发生改变，且脂联素可以提高野生小鼠的运动能力，但对3xTg-AD小鼠的运动能力没有影响。各组小鼠在中央区域或外周区域的活动时间占总时间的百分比如表1所示，3xTg-AD+Saline组在中央区域的时间百分比明显低于WT+Saline组(P<0.01)，给予脂联素后，3xTg-AD小鼠在中央区域的时间百分比明显提高(P<0.01)。同时，3xTg-AD+Saline组小鼠在外周区域的时间百分比明显高于WT+Saline组(P<0.01)和3xTg-AD +APN组(P<0.01)。以上结果表明9月龄3xTg-AD小鼠出现焦虑情绪，而脂联素可以减轻小鼠的焦虑情绪。

2.2脂联素可减轻3xTg-AD小鼠的识别记忆能力损伤

新物体识别实验是利用啮齿类动物喜欢探索新事物的特性，通过比较探索新旧物体所用的时间来检测其识别记忆能力。表2显示各组小鼠的新旧物体识别指数和辨别指数。结果表明，3xTg-AD+Saline组小鼠的旧物体识别指数高于新物体识别指数，且二者之间没有统计学差异(t=-1.4,P>0.05)；但WT+Saline组小鼠的新物体识别指数明显高于旧物体识别指数，且二者间具有统计学差异(t=2.9,P<0.05)，说明3xTg-AD小鼠没有保留对旧物体的记忆，故无法辨别新旧物体，其识别记忆能力已经损伤。给予脂联素后，3xTg-AD小鼠的新物体识别指数明显高于旧物体识别指数(t=2.8,P<0.05)，表明脂联素可以减轻3xTg-AD小鼠识别记忆能力的损伤。此外，3xTg-AD+Saline组小鼠的辨别指数明显低于WT+Saline组(P<0.01)，说明3xTg-AD小鼠遗忘了熟悉期见过的旧物体，花费了更多的时间去探索旧物体而减少了对新物体的探索。给予脂联素干预后，3xTg-AD小鼠的辨别指数明显升高 (P<0.01)，表明药物处理后，3xTg-AD小鼠探索新物体的时间多于旧物体，即小鼠记住了以往见过的旧物体，从而利用更多的时间去探索新物体。以上结果表明9月龄3xTg-AD小鼠的物体识别记忆能力3xTg-AD已损伤，而脂联素预处理可以改善这一损伤。

GroupDistance(cm)Timespentincenter(%)Timespentinperiphery(%)WT+Saline1959.4±447.130.6±5.169.4±5.1WT+APN2816.8±262.3*29.3±4.470.7±4.43xTg-AD+Saline1908.9±392.319.0±3.6**81.0±3.6**3xTg-AD+APN1863.1±244.128.3±4.5##71.7±4.5##

WT: Wild type; 3xTg-AD: Triple-transgenicAD; APN: Adiponectin

*P<0.05vsWT+Saline group；##P<0.01vs3xTg-AD+Saline group

GroupNovelobjectFamiliarobjectDiscriminationindexWT+Saline59.0±7.0*41.0±7.018.0±8.2##WT+APN65.8±6.6*34.2±6.631.7±7.73xTg-AD+Saline41.7±8.858.3±8.8-16.7±10.13xTg-AD+APN57.8±7.7*42.2±7.715.7±8.8##

*P<0.05vsfamiliar object group；##P<0.01vs3xTg-AD+Saline group

2.3脂联素可改善3xTg-AD小鼠的工作记忆能力损伤

Y迷宫主要用于测试动物的工作记忆能力。各组小鼠的自发交替正确率如表3所示，3xTg-AD+Saline组明显低于WT+Saline组(P<0.01)，表明9月龄3xTg-AD小鼠的工作记忆能力已经出现明显损害。经过脂联素干预后，3xTg-AD小鼠的进臂正确率明显高于3xTg-AD+Saline组(P<0.01)，说明脂联素能够逆转3xTg-AD小鼠工作记忆能力的损伤。此外，各组小鼠的总进臂次数没有统计学差异，表明AD相关基因突变和脂联素预处理均未对小鼠的运动能力和探索欲望产生影响。

GroupNumberofarmentriesSpontaneousalternation(%)WT+Saline32.7±2.756.6±4.6WT+APN33.6±2.560.1±5.23xTg-AD+Saline31.0±1.440.0±1.7**3xTg-AD+APN32.7±1.653.9±5.6##

**P<0.01vsWT+Saline;##P<0.01vs3xTg-AD+Saline

3 讨论

三转基因AD(3xTg-AD)小鼠是近年来比较流行的一种AD动物模型，能够全面展示AD的病理特征，并表现出多种学习记忆能力的损伤，从而更好地模拟AD病人的临床表现。研究表明，3xTg-AD小鼠4月龄时已出现长时程的记忆提取损伤，且随着年龄的增长这种损伤将会逐渐加重[12]。本研究发现9月龄3xTg-AD小鼠的旧物体识别指数明显升高，新物体识别指数明显降低，辨别指数<0，提示3xTg-AD小鼠的识别记忆能力明显损伤。同时，9月龄的3xTg-AD小鼠在Y迷宫实验中的自发交替正确率也明显下降，表明其短期工作记忆能力也受到损伤。此外，还发现9月龄3xTg-AD小鼠在旷场中央区域的活动时间明显缩短，而在外周区域活动时间延长，表现出一定的焦虑情绪。

脂联素作为一种主要来源于脂肪细胞的蛋白质激素，是否在AD等神经退行性疾病中发挥作用，及其作用效果尚存争议。流行病学调查发现血清脂联素水平与AD的发病密切相关，在轻度认知功能障碍和AD患者中血清脂联素水平明显下降，且脂联素减少是AD病程中的一个重要指标[13]。但也有研究发现AD患者血清脂联素水平升高[14]，然而这种升高是AD发病的原因还是AD早期的代偿性增加还难以确定。同时部分离体实验证实，脂联素可以减少Aβ的产生和沉积，对抗Aβ和KA的神经毒性作用[4, 5]。此外，脂联素还可以通过抑制NF-κB的激活来减少促炎因子的产生和增加抗炎因子的数量，从而减轻神经炎症反应，减慢神经细胞凋亡的速度[15]。

有研究表明脂联素的球状结构域可以通过血脑屏障，但其进入脑内具有促进炎症反应的作用[16]，故本研究选取全长型脂联素，采用侧脑室注射给药的方法以确保脂联素能够直接在中枢神经系统发挥作用，同时避免腹腔或静脉给药所带来的广泛外周效应。本研究采用3种不同的行为学手段观察侧脑室慢性给予脂联素后对3xTg-AD小鼠的焦虑情绪、识别记忆和工作记忆能力损害的影响。在旷场实验中发现，脂联素可以减轻9月龄3xTg-AD小鼠的焦虑程度，而以往也曾报道侧脑室注射脂联素可以使小鼠的抑郁程度明显降低[17]。因此我们推测，脂联素可以缓解在AD病程中出现的焦虑、抑郁等多种情绪改变。在新物体识别实验中，当给予脂联素后，3xTg-AD小鼠对新物体的识别指数和辨别指数均明显升高，表明其能够识别出旧物体进而更多的去探索新物体，因此脂联素可以有效改善3xTg-AD小鼠识别记忆能力的损伤。在Y迷宫实验中，给予脂联素后，3xTg-AD小鼠的自发交替正确率明显提高，其工作记忆能力损伤明显好转。以上结果表明，脂联素对3xTg-AD小鼠的物体识别记忆能力和短期工作记忆能力损伤均有明显改善作用。而近期报道发现，脂联素的类似物Osmotin可以减轻Aβ1-42所导致的小鼠空间记忆能力损害，减少脑内Aβ的沉积及tau蛋白磷酸化[18]。因此我们推测脂联素可能通过影响Aβ和磷酸化tau蛋白的水平，以及减轻神经炎症反应，来逆转3xTg-AD小鼠出现的焦虑情绪和短期记忆能力损伤。

总之，本实验结果表明，9月龄3xTg-AD小鼠具有明显的焦虑情绪，其对新物体的识别能力和短期工作记忆能力也有明显损伤；脂联素预处理能够有效改善其焦虑情绪和识别记忆、工作记忆能力的损伤。本研究为后续脂联素与AD关系的研究提供初步的行为学实验证据，提示脂联素对于AD的预防和治疗可能具有一定的积极作用。同时脂联素发挥神经保护作用的可能机制，例如能否直接减轻Aβ沉积和tau蛋白磷酸化，以及直接影响脑内促炎因子和抗炎因子的表达，减轻神经炎性反应等，相关研究正在进行中。

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EffectsofadiponectinontheanxietyandmemoryimpairmentintripletransgenicAlzheimer'sdiseasemodelmice

QU Xue-song1, SHI Hui1,2, CAO Xiu-li1, DONG Xue-fan1, LI Tian1, JIAO Juan-juan1, QI Jin-shun1, WU Mei-na1△

(1. Department of Physiology, Shanxi Medical University, Key Laboratory for Cellular Physiology of Ministry ofEducation, Taiyuan 030001; 2. Intensive Care Unit, Chifeng Municipal Hospital of Inner Mongolia, Chifeng 024000, China)

Objective: To investigate the effects of adiponectin (APN) on anxiety and memory impairment of 9-month-old triple transgenic Alzheimer’s disease (3xTg-AD) model mice.MethodsThe 9-month-old 3xTg-AD mice and C57BL/6J mice were randomly divided into four groups (n=8 for each group): Wild type(WT)+Saline, 3xTg-AD +Saline, WT+APN and 3xTg-AD +APN group. All mice were implanted cannula in lateral ventricle and each mouse was intracerebroventricular injected with adiponectin or saline under free moving condition after 7 days recovery. The anxiety and memory ability of each mouse were observed by using open field test, object recognition task and Y-maze test.Results①In the open field test, compared to WT+Saline group, the time of 3xTg-AD +Saline mice spent in center was significantly decreased, and the time spent in periphery was obviously increased. However, APN treatment effectively reversed the phenomenon appeared in 3xTg-AD mice, indicating that APN could alleviate the anxiety observed in 3xTg-AD mice. ②In novel object recognition task, the discrimination index of 3xTg-AD+Saline group was (-16.7±10.1)%, significantly lower than (18.0±8.2)% in WT+Saline group (P<0.01) and (15.7±8.8)% in 3xTg-AD+APN group (P<0.01), which indicated that APN could effectively prevent the recognition memory impairment in 3xTg mice. ③In Y-maze test, the spontaneous alternation rate of 3xTg-AD +Saline group was (40.0±1.7)%，significantly lower than (56.6±4.6)% in WT+Saline group and (53.9±5.6)% in 3xTg-AD +APN group (P<0.01), which indicated that APN could prevent working memory impairment in 3xTg-AD mice.ConclusionAdiponectin could effectively alleviate the anxiety and reverse the impairment of recognition memory and working memory of 9-month-old 3xTg-AD mice, and might play an important role in the prevention and treatment of AD.

adiponectin; Alzheimer’s disease (AD); triple-transgenic AD (3xTg-AD) mice; anxiety; learning and memory

R338

A

1000-6834(2017)05-405-05

10.12047/j.cjap.5498.2017.098

国家自然科学基金(31300968)；青年三晋学者支持计划专项经费资助

2016-10-08

2017-05-22

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Tel： 0351-4135117； E-mail: wmna@163.com