王玲,吕雪漫,姜琦
(吉林大学中日联谊医院,吉林长春130033)
目前视神经损伤的治疗方法存在着较大的争议[1]。近年来,以干细胞干预治疗视神经损伤已在实验动物中取得了一定的疗效[2]。关于人脐血干细胞(human umbilical cord blood stem cells,hUCBSC)对于视神经损伤的干预治疗,周丹[3]对外伤性视神经部分损伤模型大鼠以人脐血干细胞和神经营养因子干预治疗效果进行了研究,得出了人脐血干细胞和神经营养因子具有促进恢复外伤性视神经损伤动物模型视神经传导功能的结论。尹成玉等[4]对脐血间充质干细胞干预治疗视神经损伤的疗效进行了观察,得出了脐血间充质干细胞干预治疗视神经损伤患者后视力均有改善的结论。关于人脑源性神经营养因子干预治疗视神经损伤动物模型,刘勇等[5]以人脑源性神经营养因子干预治疗视神经损伤动物模型,得出了人脑源性神经营养因子移植视神经损伤动物模型后hBDNF—GFP—NSCs可以分化为神经胶质细胞、神经元外,少数可分化为视网膜神经节样细胞;移植hBDNF—GFP—NSCs可以增加RGCs存活的结论。Lv等[6]对以脑源性神经营养因子、人脐血干细胞干预视神经损伤动物模型家兔视神经的应力松弛、蠕变特性进行了研究,得出了hUCBSC和BDNF具有恢复视神经损伤动物模型应力松弛、蠕变特性的作用和干预治疗视神经损伤动物模型效果明显的结论。
本研究以钳夹法制备视神经损伤动物模型,分别以脑源性神经营养因子和人脐血干细胞进行干预治疗,以拉伸力学性能指标判断以脑源性神经营养因子、人脐血干细胞干预治疗视神经损伤模型动物的效果,旨在为视神经损伤的治疗提供生物力学基础。
健康7月龄,体质量330~340 g雌性SD大鼠60只,由吉林大学动物实验中心提供。在笼中饲养各组大鼠,大鼠饲养室温度23~25℃,室内保持空气流通,自然光照,室内相对湿度60~72%,实验前对大鼠眼底和外眼进行检查,对无病变大鼠纳入实验。
60只SD大鼠随机分为视神经损伤动物模型组20只,视神经损伤动物模型以BDNF干预组20只,视神经损伤模型以人hUCBSC干预组20只,在60只大鼠中随机取20只正常眼(左眼)设为正常对照组。.
按文献[7]的方法建立视神经损伤大鼠模型,大鼠俯卧位固定于手术台上,向大鼠腹腔内注射0.1%的乌拉坦(5 mg/kg)水合氯醛,麻醉大鼠后将大鼠右眼顶侧眶上皮肤切开,露出眶壁和眶上缘切迹,在眶上缘切迹处将视神经管方向两侧部分眶壁骨板(宽5 mm,深6~7 mm)切除,将后部眼球筋膜剪开,沿上直肌向球后分离,使眼球后视神经暴露。在离后极部约3 mm游离视神经约4 mm,以上海医疗器械厂生产的W40160恒定压力反向血管夹(相当于98 g)钳夹同一部位的视神经10 s。用庆大霉素液冲洗术野10次后,以青岛耐克医材有限公司生产的10~0号尼龙线分层缝合。术后在大鼠眼结膜囊内涂红霉素眼膏。
视神经损伤动物模型造模后立即观察,将大鼠视网膜血管无出血或梗塞,伤眼瞳孔散大间接对光反射存在,直接对光反射消失作为造模成功的大鼠纳入实验。
对视神经损伤动物模型以BDNF干预组大鼠于造模7 d后[7],以瑞士哈美顿公司生产的微量注射器向大鼠玻璃体内一次性注射上海酶联生物科技有限公司生产的脑源性神经营养因子BDNF 50 ng。对视神经损伤大鼠以hUCBSC干预组大鼠于造模7 d后,用以瑞士哈美顿公司生产的微量注射器向大鼠玻璃体内一次性注射深圳北科生物公司生产的hUCBSC 106个[7]。
建模30 d后处死各组大鼠,在YZ6F直接检眼镜下,以手术刀切取大鼠眶内段同一部位视神经各16个,将视神经试样置于装有生理盐水的器皿内,置于4℃冰箱内保存。
按文献[8]的方法取各组大鼠眶内同一部位视神经各一条,长为5 mm,先以戊二醛(4%)前固定,之后以锇酸(1%)后固定,以丙酮梯度进行脱水,然后进行临界点干燥,之后进行真空喷金镀膜,以德国卡尔蔡司公司生产的MERLIN Compact型场发射扫描电镜观察各组视神经的组织形态。
以长春试验机研究所集团生产的MODEL55100型电子拉力试验机对各组大鼠视神经试样进行一维拉伸实验,以读数显微镜测量各组大鼠视神经试样的长度和直径,各组试样长度均为10 mm,直径为0.82~0.88 mm。按文献[7]的方法分别对每个大鼠视神经试样进行预调处理。各组大鼠视神经试样拉伸实验环境温度为36.5±1.0℃,分别将各组大鼠视神经试样装夹于试验机的软组织夹头内,以1 mm/min的载荷增加速度对视神经试样进行拉伸,实验结束后,计算机自动输出视神经试样的拉伸实验数据和曲线。
以美国SPSS16.0软件包(SPSS,Chicago,IL,USA)进行数据分析,计量资料以mean±SD表示,组间数据差异的比较采用单因素方差分析法和Sceffe法,P<0.05为差异有显著性。
各组视神经的组织形态扫描电镜观察结果见图1。
图1 正常对照组、视神经损动物模型组、视神经损伤动物模型以hUCBSC治疗组、视神经损伤动物模型以DBNF治疗组视神经电子显微镜照片(×100)。Fig 1 The normal control group,the optic nerve injury model group,the optic nerve injury animal model group treated with hUCBSC,the optic nerve injury animal model treated with DBNF(×100).
扫描电镜观察结果表明,正常对照组视神经轴突等内容物形态清晰,细胞核均匀,无增大、无明显水肿,无炎症细胞,见图1a。视神经损伤动物模型组视神经结构模糊,纤维排列稀疏,轴突、核碎裂轴突等的组织形态发生了改变,见图1b。视神经损伤动物模型以BDNF治疗组视神经部分胶质细胞核排列不规则,有少量细胞空泡,部分神经纤维排列较整齐,轴突形态有一定的恢复,神经纤维迂曲、偶见胞核碎片,视神经无明显变细,见图1c。视神经损伤动物模型以hUCBSC治疗组视神经纤维排列较密集,胶质细胞核增多,多数轴突形态正常,见图1d。
各组大鼠视神经一维拉伸实验结果见表1。
表1 各组大鼠视神经一维拉伸实验结果(n=15)Table 1 Tensile test results of optic nerve in rats of each group(n=15)
结果用mean±SD表示,每组15个样本,aP<0.05,vs.正常对照组;bP<0.05,vs.视神经损伤动物模型组;cP<0.05,vs.视神经损伤动物模型以BDNF治疗组;dP<0.05,vs.视神经损伤动物模型以hUCBSC治疗组。
各组大鼠视神经一维拉伸实验结果表明,视神经损伤模型以BDNF干预组动物视神经的最大载荷、最大应力、最大应变、弹性限度载荷、弹性限度应力小于视神经损伤模型以hUCBSC干预组,差异显著(P<0.05)。视神经损伤动物模型组视神经的拉伸最大载荷、最大应力、最大应变、弹性限度载荷、弹性限度应力小于视神经损伤模型以hUCBSC、以BDNF干预组差异显著(P<0.05)。
各组大鼠视神经一维拉伸应力-应变曲线见图2。
图2 各组大鼠视神经一维拉伸应力-应变曲线Fig 2 The stress-strain curves of optic nerve in rats of each group
由各组视神经拉伸实验得出的应力、应变数据,分别建立各组大鼠试样的应力-应变函数关系表达式如下:
正常对照组:σ(ε)=26054e5-73.00e4+67.75 e3-13.07+1.632
视神经损伤动物模型组:σ(ε)=35.29e5-76.28e4+54.03e3-4.64e2+0.83
以hUCBSC干预治疗组:σ(ε)=46.89e5-117.18e4+95.54e3-18.84e2+2.23
以BDNF干预治疗组:σ(ε)=61.46e5-137.36e4+100.72e3-17.99e2+2.00
各组大鼠视神经组织形态观察结果发现,视神经损伤动物模型组视神经结构模糊,纤维排列稀疏,轴突、核碎裂轴突等的组织形态发生了改变。视神经损伤动物模型以BDNF干预治疗组视神经部分胶质细胞核排列不规则,有少量细胞空泡,部分神经纤维排列较整齐,神经纤维迂曲、偶见胞核碎片,视神经无明显变细。视神经损伤模型以hUCBSC干预治疗组视神经大面积神经纤维排列较密集,胶质细胞核增多,轴突形态多数正常。说明BDNF、hUCBSC对恢复损伤视神经的组织形态具有一定的作用,hUCBSC恢复损伤视神经组织形态的作用好于BDNF。
各组大鼠视神经拉伸实验结果表明,视神经损伤动物模型组大鼠视神经的拉伸力学性能发生了改变,视神经损伤动物模型通过以hUCBSC和以BDNF干预治疗后,提高了视神经损伤模型大鼠视神经的拉伸力学性能指标,视神经的生理功能要求其神经纤维结构保持完整;具有完整结构的视神经才具有一定的承受变形和载荷的能力;如果神经纤维局部受到损伤或被切断,会使视神经部分或全部丧失承受变形和载荷的能力[7]。分析认为,视神经损伤模型大鼠视神经损伤后,正常视神经纤维排列不规则,结构紊乱,组织形态发生了改变,使其力学性能发生了改变。
李云琴等[9]研究了以hUCBSC干预视神经损伤动物模型后的效果,得出了视神经损伤模型大鼠玻璃体腔注射hUCBSC可减缓视网膜中RGC的凋亡,对RGC具有保护作用的结论。脐血间充质干细胞可向其它组织分化,具有移植后免疫排斥反应低的特点,间充质干细胞已广泛的应用于生物工程和医学领域[10]。
BDNF对神经活动起着重要作用,视神经损伤后其节细胞损伤及死亡的一个很重要的原因是切断了远端长期供应胶质细胞的神经营养因子,使RGCS营养不良而死亡,如果及时补充外源性的神经营养因子,损伤的RGCS仍能较好地生长[11],研究证实,损伤后的神经系统,补充神经营养因子后可以促进轴突再生和神经元存活[12]。本研究通过以hUCBS对视神经损伤动物进行干预治疗后,分泌了多种神经营养因子,增加了神经损伤区的胶质细胞,对破坏的视神经组织形态有所改变,力学性能指标也有一定的提高。
本研究发现,损伤的视神经的组织形态恢复的越好,力学性能指标恢复的越好,本研究得出的视神经的组织形态观察结果、拉伸实验结果证明视神经损伤模型以hUCBSC、以BDNF干预治疗后对视神经损伤模型动物的视神经组织形态、力学性能指标具有提高的作用,说明hUCBSC、BDNF干预治疗对视神经损伤模型大鼠均具有一定的疗效,但hUCBSC的干预治疗效果更好。