TGM2高表达对GES1细胞生长增殖的影响

吴霞+艾小红+彭顺清

【中图分类号】R251 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）10-00-01

胃癌是我国最常见的十大恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率均居消化道恶性肿瘤之首[1，2][3，4]，是危害人们的健康与生命的重大疾病之一。早期发现，早期治疗对胃癌防治具有十分重要的临床价值与意义。课题组前期运用定量蛋白质组学技术，发现组织型转谷氨酰胺酶（Tissue Transglutaminase，TGM2）蛋白在胃粘膜癌变过程中呈现表达逐渐升高[5]。然而，TGM2蛋白在胃粘膜癌变过程中的作用及机制仍需深入研究，本文旨在了解TGM2在永生化胃上皮细胞GES1增殖中的作用，为阐明胃癌发病的分子机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞系

永生化胃上皮细胞GES1和胃癌MGC803细胞购自中国医学科学院上海细胞生物研究所，用10%血清胎牛的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱常规培养。

1.2 质粒与主要试剂

pCDNA3.1真核表达载体由中南大学肿瘤研究所馈赠。高保真酶、T4DNALigandmerase购置宝生物工程（大连）有限公司。限制性内切酶HindIII和XhoI购置Fermentas公司。一抗与二抗购置SantaCruz公司。

1.3 引物

采用Premier6.0软件设计重组pCDNA3.1-TGM2和β-actin内对照引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4 构建pCDNA3.1-TGM2真核表达质粒

收集胃癌MGC803细胞，抽提细胞总RNA，AMV逆转录后进行PCR扩增。反应扩增条件：96℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，35循环，72℃10min。回收TGM2基因片断，纯化后用限制性内切酶HindIII和XhoI酶切，分离纯化后连接。将连接产物，转化DH5α感受态，选取菌落扩增，PCR和酶切鉴定，送invitrogen公司进行序列测定，即获得pCDNA3.1-TGM2真核表达质粒。

1.5 TGM2稳定表达细胞的建立

1.5.1 Western-blot检测TGM2蛋白的表达

将GES1细胞接种于6孔板中，采用Lipofactamine2000脂质体进行pCDNA3.1-TGM2真核表达质粒转染（pCDNA3.1为载体对照），G418筛选后汇合克隆，建立TGM2稳定表达的GES1细胞系，即GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1。提取细胞总蛋白质，以30?g/泳道的蛋白进行10%不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜后5%脱脂牛奶封闭，鼠抗人TGM2单抗（1：1000）与抗β-actin单体（1：2000）4℃孵育过夜，洗膜后羊抗鼠二抗（1：1000）室温孵育，洗膜、发光、曝光、显影与定影，分析TGM2蛋白的表达。

1.5.2 免疫荧光染色

将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞接种于预先放置盖玻片的6孔板中，制作细胞爬片，洗涤细胞，用甲醇与丙酮（1：1）混合液固定；洗涤细胞，0.1%TritonX-100室温孵育20min，洗涤细胞，用鼠抗人TGM2单抗（1：1000）37℃孵育1h，洗涤细胞，用FITC标记的羊抗鼠二抗37℃孵育1h，洗涤细胞，甘油封片，制备细胞爬片，置于荧光显微镜下观察、拍照。

1.6 绘制细胞生长曲线

将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞接种于96孔培养板中，每组设3个平行孔（设空白对照孔），培养24h后，每孔加入20?L5mg/mL的MTT，培养4h，加入150?L的DMSO，溶解蓝紫色结晶物，置于酶标仪中用490nm波长测定吸光度值。每天检测一次，每次重复测量3次，取平均值进行校正（测量值与第一天测量值之商），校正值代表测量值，连续检测7天，将测量值绘制在坐标纸上，绘制细胞生长曲线。

1.7 细胞周期和凋亡检测

将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞用无血清RPMI1640培养细胞24h后，用血清培养基培养24h后，收集细胞，PBS洗涤，用4℃预冷70%乙醇固定2h，PBS洗涤，加入含20mg/LRNA酶Tris-HCl液，37℃孵育30min，用50mg/L碘化丙锭染色，收集送公司进行流式细胞术分析，检测细胞周期中各个时相比例与细胞凋亡率，计算细胞增殖指数，增殖指数（PI）=（S+G2）/（G0/1+S+G2）。

1.8 平皿克隆形成实验

将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞以500个/孔接细胞种于6孔板中，每组设3平行孔，静置培养1周后，用3：1甲醇与冰乙酸的混合液固定，結晶紫染色，显微镜下计数细胞克隆数（大于50个细胞），计算克隆形成率，克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.9 软琼脂集落形成实验

用琼脂糖与RPMI1640培养液配制0.5%的底层琼脂，将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞调整密度为3×103个/mL，用琼脂糖与RPMI1640培养液混合加热溶解后，加入细胞，调整密度为5×103个/孔，配制0.3%顶层琼脂，每组设3个平行孔，培养2周后，观察集落（≥50个细胞为1个集落）形成情况，每孔随机选择10个低倍视野计数集落数，每视野与每孔均重复3次，计算每孔形成集落数平均，计算细胞的集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。

1.10 统计学分析

采用SPSS20.0统计软件对数据进行统计分析，所有数据均以Mean+SD表示（即±s），两组均数比较采用t检验，三组及以上比较采用单因素方差分析（OnewayANOVA），以P<0.05表示差异具有统计学意义。endprint

2 结果

2.1 pcDNA3.1-TGM2真核表达质粒的重组

提取MGC803细胞总RNA，用逆转录产物作为模板，加入TGM2引物，经PCR扩增，TGM2扩增产物回收、酶切、连接、转化，经HindIII和XhoI酶切（图1）和测序鉴定，获得pCDNA3.1-TGM2真核表达质粒，测序后序列与目的序列完全一致。

2.2 建立TGM2稳定高表达GES1细胞系

将pcDNA3.1-TGM2真核表达质粒（pCDNA3.1质粒为对照）转染GES1细胞，经G418筛选2周，汇合克隆培养，建立TGM2稳定高表达的GES1细胞系，即GES1-TGM2细胞（GES1- pcDNA3.1为对照）。经细胞免疫荧光与Western-blot检测GES1细胞中TGM2表达情况，结果显示，GES1-TGM2细胞中TGM2蛋白表达明显高于GES1- pcDNA3.1细胞（图2）。

A：细胞免疫荧光观察GES1细胞中TGM2蛋白的表达。

B：Western-blot检测GES1细胞中TGM2蛋白的表达，1：GES1-TGM2细胞，2：GES1-pcDNA3.1细胞。

2.3 TGM2高表达对GES1细胞生长的影响

将GES1-TGM2、GES1-pcDNA3.1和GES1细胞接种于96孔板后，采用MTT法测定三组的吸光度值，连续检测7天，绘制不同细胞的生长曲线。结果显示，GES1-TGM2细胞的生长速度较GES1-pcDNA3.1和GES1明显加快（图3，P<0.01）。结果提示TGM2高表达可以促进GES1细胞的生长。

2.4 TGM2高表达对GES1细胞停泊依赖性生长的影响

采用平板克隆形成实验检测TGM2高表达对GES1细胞停泊依赖性生长的影响，结果显示，GES1-TGM2细胞的克隆形成率较GES1-pcDNA3.1和GES1细胞明显增多（表2，P<0.01）。结果提示TGM2高表达可以促进GES1细胞的增殖。

2.5 TGM2高表达对GES1细胞非停泊依赖性生长的影响

采用软琼脂集落形成实验检测TGM2高表达对GES1细胞非停泊依赖性生长的影响，结果显示，GES1-TGM2细胞形成的集落较GES1-pcDNA3.1和GES1细胞体积大，集落数目多，集落形成率高，（表3，P<0.01）。结果提示TGM2高表达可以促进GES1细胞的停泊非依赖性生长，提升细胞的增殖能力。

2.6 TGM2高表达对GES1细胞周期分布的影响

采用流式细胞仪检测GES1-TGM2細胞的周期，结果显示，GES1-TGM2细胞群中G0/G1期百分率较GES1-pcDNA3.1和GES1细胞明显减少，而S期细胞的百分率则明显增加（表4，P<0.01），TGM2高表达后GES1细胞的增殖指数升高。结果提示，TGM2高表达后增加细胞增殖指数而促进GES1细胞的增殖。

2.7 TGM2高表达对GES1细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪检测TGM2高表达后对GES1细胞凋亡的影响，结果显示，GES1-TGM2细胞的凋亡率明显低于GES1-pcDNA3.1和GES1细胞（表5，P<0.01）。结果表明TGM2高表达可抑制GES1细胞的凋亡。

3 讨论

组织型转谷氨酰胺酶（Tissue Transglutaminase，TGM2）是转谷氨酰胺酶家族中成员之一，由687个氨基酸残基组成、分子量78KD的钙离子依赖性的多功能蛋白，其包括4个结构域，即含纤维连接蛋白结合位点的N-端β三明治结构域、含底物结合位点和催化三联体结构的α/β催化核心区及含GTP结合位点、肾上腺素受体作用位点及磷脂酶Cδ1位点的两个 C-端β桶状结构[6]。

近年来，大量的研究表明，TGM2蛋白表达与多种恶性肿瘤细胞的增殖与转移关系密切。TGM2蛋白可以激活NF-κB通路，诱导Bcl-xL和BFLI抗凋亡蛋白的表达，促进肿瘤细胞的增殖[7]。TGM2在乳腺癌、结肠癌和卵巢癌等恶性肿瘤中表达均升高[8]。有研究通过蛋白质组学技术发现，在转移性肺癌细胞中发现TGM2蛋白表达上调[9]。TGM2蛋白可被表皮生长因子（EGF）诱导后表达，导致化疗药物诱导瘤细胞的凋亡下降 [10]。TGM2表达激活酪氨酸激酶FAK，活化抗凋亡信号通路如PI3/AKT等，促进细胞增殖[11]。TGM2表达后促进TGF诱导乳腺癌细胞产生EMT现象，瘤细胞产生化疗抵抗，细胞的侵袭转移能力增加，然而，抑制TGM2表达后，TGF-β则无法诱导使瘤细胞产生EMT现象[12]。另外，TGM2表达可促进肿瘤间质中TGF-β分泌增加，诱导瘤细胞产生EMT，提高瘤细胞的迁移与侵袭能力[13]。

本研究发现TGM2 高表达后，GES1细胞的生长加速，增殖能力增强，S期细胞比例明显增多，G1细胞比例降低，细胞增殖指数增加，细胞凋亡率降低，这些结果表明，TGM2导入GES1细胞后，通过影响细胞周期与凋亡，促进细胞的生长增殖。与以往研究基本一致，为证实TGM2为胃癌早期诊断潜在分子标志物提供了实验依据。总之，本研究证实了TGM2通过增加GES1细胞增殖指数，抑制细胞凋亡，发挥其促进细胞增殖的作用。然而，TGM2影响细胞的生物学表型涉及复杂的信号网络，仍有待后续的深入研究。

参考文献：

Weso?owska M， Pawlik P， Jagodzinski PP. The clinicopathologic significance of estrogen receptors in human gastric carcinoma[J].Biomed Pharmacother. 2016， 83：314-322.endprint

Katoh H， Ishikawa S. Genomic pathobiology of gastric carcinoma[J].Pathol Int. 2017，67（2）：63-71.

Chen W， Zheng R， Baade PD， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]. CA Cancer J Clin. 2016，66（2）：115-132.

張志伟， 汤国辉， 赵强， 等. AKT-p27Kip1-Cyclin E在胃癌组织中的表达及意义[J].世界华人消化杂志，2011，19（21）：2233-2240.

张志伟. 胃粘膜上皮癌变相关蛋白质分子的筛选与鉴定[D]. 2015， 南华大学博士学位论文.

Pietsch M， Wodtke R， Pietzsch J， et al. Tissue transglutaminase：an emerging target for therapy and imaging[J]. Bioorg Med Chem Lett. 2013， 23（24）：6528-6543.

Li B， Cerione RA， Antonyak M. Tissue transglutaminase and its role in human cancer progression[J]. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 2011， 78：247-293.

Budillon A， Carbone C， Di Gennaro E. Tissue transglutaminase：a new target to reverse cancer drug resistance[J]. Amino Acids. 2013， 44（1）：63-72.

Nadalutti C， Viiri KM， Kaukinen K， et al. Extracellular transglutaminase 2 has a role in cell adhesion， whereas intracellular transglutaminase 2 is involved in regulation of endothelial cell proliferation and apoptosis[J]. Cell Prolif. 2011， 44（1）：49-58.

Jiang D， Ying W， Lu Y， et al. Identification of metastasis-associated proteins by proteomic analysis and functional exploration of interleukin-18 in metastasis[J]. Proteomics. 2003， 3（5）：724-737.

Antonyak MA， Miller AM， Jansen JM， et al. Augmentation of tissue transglutaminase expression and activation by epi-dermal growth factor inhibit doxorubicin-induced apoptosis in human breast cancer cells[J]. J Biol Chem. 2004， 79（40）：41461-41467.

Fu J， Yang QY， Sai K， et al. TGM2 inhibition attenuates ID1 expression in CD44-high glioma-initiating cells[J]. Neuro Oncol. 2013，15（10）：1353-65.

Obinata A， Osakabe K， Yamaguchi M， et al. Tgm2/Gh， Gbx1 and TGF-beta are involved in retinoic acid-induced transdifferentiation from epidermis to mucosal epithelium[J]. Int J Dev Biol. 2011，55（10-12）：933-43.endprint