仔猪腹泻大肠杆菌菌种保存的研究

2017-10-24 05:36王晓燕张建华刘玉英尉玉杰王俊超董焕声
山东畜牧兽医 2017年10期
关键词:冻干毒力菌种

王晓燕 张建华 刘玉英 尉玉杰 王俊超 董焕声*

仔猪腹泻大肠杆菌菌种保存的研究

王晓燕①①张建华①刘玉英①尉玉杰①王俊超①董焕声*①

(①青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛 2661091 ①山东省莱阳市畜牧兽医局)

本文研究了4株仔猪腹泻大肠杆菌菌株不同代次培养的菌液,制成甘油菌后,保存在-20 6℃个月,分析细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽药典》规定标准;4批冻干保存的菌种,经过36个月的保存后,分析细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽药典》规定标准。本文为大肠杆菌病的致病机理及疾病的潜伏期提供了理论依据。

仔猪 大肠杆菌 保存

仔猪大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的一种急性高度致死性传染病。本病最常发生于初生7日龄以内的哺乳仔猪,因哺乳仔猪下痢,机体迅速脱水,导致全身衰弱而死亡,给养猪业造成严重经济损失。由于仔猪生长期和病原菌血清型的差异,此病可分仔猪黄痢及仔猪白痢两种,猪场传染上该病很难根除。本文针对已经分离得到的大肠杆菌菌株进行保存期的试验,观察大肠杆菌分离冻存后的活性及生化特性。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)甘油菌:C835491、C835492、

C835493、C8354944个批次;C836441、C836442、

C836443、C8364444个批次;C839181、C839182、

C839183、C8391844个批次。冻干菌:C835491、

C835492、C835493、C8354944个批次;C836441、

C836442、C836443、C8364444个批次;C839181、

C839182、C839183、C8391844个批次。(2)试验动物:小白鼠、仔猪。(3)发酵管:葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、靛基质、枸橼酸7种,购于杭州天和微生物制剂有限公司。

1.2 方法 试验菌液分别抽样,加入20%的甘油,分装若干小瓶,2ml/瓶,-20℃冰箱冻结,保存1、3、6、12个月。冻干菌种-20℃冰箱冻结,保存1、3、6、12、24、36个月。定期将被试验的菌种取出检测。取出的菌种检测方法:将菌种划线接种到Minca培养基上,37℃培养20h,观察菌落特征,挑单菌落进行革兰氏染色,观察菌体的形态。将生长好的单一菌落无污染的挑到7种发酵管中

37℃培养12h,完成吲哚试验;M.R.试验;VP试验试验;H2S试验。血清学特性检测:用相对应的因子血清和培养的细菌作玻板凝集试验,观察玻板凝集试验的结果[1-2]。毒力测定:将3种血清型致病性大肠杆菌应用营养肉汤繁殖12h,进行细菌计数,再用无菌生理盐水进行稀释,以麦氏比浊法进行细菌计数,调节浓度至约3×106cfu/ml,采用30日龄ICR小鼠(体重约26g)随机分成2组,以灌胃的方法对实验组动物进行接种,0.2ml/鼠,对照组注射灭菌生理盐水0.2ml/鼠,实验组小鼠均于24h开始出现精神委靡,饮、食欲下降,打堆,大部分小鼠尿色变深[3];死亡多发生于接种后36~72h。对照组未见异常。对死亡小鼠进行剖检发现,所有死亡小鼠的腹腔内均有浆液性渗出;脾脏坏死;肝脏边缘坏死,肺脏无明显病变;肠道充满黄色液体,部分小鼠的肠系膜出现水肿[3-4]。死亡率为87%。从各组死亡小鼠的十二指肠采样接种麦康凯培养基,均能分离到大肠杆菌。

2 试验结果与分析

2.1 甘油保存菌种 在-20℃冰箱保存1、3、6、12个月的大肠杆菌甘油菌,经过再次培养,完全符合大肠杆菌的菌落形态、菌落特征,菌落光滑圆整,菌种生化特性鉴定如表1所示。

表1 保存1~12个月再培养的菌种生化特性

用相对应的因子血清,做玻板凝集试验,结果:各保存期再次培养的菌种,均能凝集相对应的因子血清,完全符合大肠杆菌的血清学特性。毒力检测结果:试验组小鼠均于24h开始出现精神委靡,饮、食欲下降,打堆,大部分小鼠尿色变深;死亡多发生于接种后36~72h。从各组死亡小鼠的十二指肠采样接种麦康凯培养基,均能分离到大肠杆菌。免疫原性结果:按本规程制成疫苗,达到成品的质量标准。

2.2 冻干菌种 在-20℃冰箱保存1、3、6、12、24、36个月的冻干菌种,经过再次培养,完全符合大肠杆菌的菌落形态、菌落特征,菌落光滑圆整,菌种生化特性鉴定如表2所示。

表2 保存1~36个月再培养的菌种生化特性

用相对应的因子血清,做玻板凝集试验,结果:各保存期再次培养的菌种,均能凝集相对应的因子血清,完全符合大肠杆菌的血清学特性。

3 结论

仔猪腹泻大肠杆菌3个菌株的4个不同代次培养的菌液制备的4批甘油菌在-20℃保存6个月,细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定标准;4批冻干保存的菌种,在-20℃冰箱中保存,经过36个月,细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定标准。

[1] 文彩芳, 郗立新, 赵珊等. 四川宜宾地区规模猪场腹泻仔猪大肠杆菌耐药性监测及血清型鉴定[J]. 养猪, 2015, 01: 113-115.

[2] 刘国平, 吴斌, 刘梦元等. 致仔猪水肿病大肠杆菌的分离、鉴定及生物学特性[J].中国兽医学报, 2005,01: 31-33.

[3] 王晓丽, 王永山, 诸玉梅等. 5株乳酸菌的分离鉴定与生物学特性研究[J]. 江苏农业科学, 2011, 01: 390-392.

[4] 郭雪丽, 王红宝, 李红丽等. 山西省致病性猪大肠杆菌分离及生物特性研究[J]. 养猪, 2015, 02: 97-99.

S852.61+2

A

1007-1733(2017)10-0006-02

2017–06–09)

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