絮凝剂对紫云英根瘤菌发酵液絮凝效果的研究

吴湘龙，雷 潇，易世鸣，刘 欢，孟祥池，刘宇波，曾 奥

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

絮凝剂对紫云英根瘤菌发酵液絮凝效果的研究

吴湘龙，雷 潇，易世鸣，刘 欢，孟祥池，刘宇波，曾 奥

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

根瘤菌发酵会产生大量的胞外粘液，使发酵液变得十分粘稠，从而严重影响发酵液的固液分离。为降低发酵液的菌体收集难度，研究在优化根瘤菌发酵水平的基础上，选用7种絮凝剂对发酵液进行处理，以絮凝率、蛋白去除率、多糖去除率、上清液菌体含量为指标进行筛选。结果表明：聚合氯化铝（50 mg/L）絮凝速率最快，蛋白多糖去除率高，但粘壁现象严重，上清菌体含量少；而阳离子聚丙烯酰胺（100 mg/L）表现出良好的上清菌体含量以及多糖去除率，且粘壁现象少，最适用于紫云英根瘤菌发酵液多糖去除和菌体的收集。

絮凝剂；紫云英根瘤菌；多糖；絮凝

紫云英为水稻田常用绿肥，能够增加土壤肥力，改善土壤理化性质，特别是对于近年来稻田土壤出现的一系列问题，紫云英种植都有一定的功效。因此，继续扩大紫云英推广面积具有重要意义。与紫云英共生固氮的根瘤菌剂因成本低、不影响环境和固氮效果好，也受到普遍受关注。根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用虽在19世纪晚期就已经被科学家所认识，但在我国的推广应用还不够，主要还是受制于化学肥料高效方便快捷的冲击[1-3]。

商业生产根瘤菌剂的质量主要受2个因素的影响，一是发酵水平，另一个是有效活菌数。已有文献报道，在发酵液中加入豆芽汁能显著提高发酵水平。这主要是因为豆科植物发芽初期根部能分泌一种类黄酮物质，该物质能够刺激周围根瘤菌的生长[4-5]。但研究发现，在发酵液中添加20%的豆芽汁，所需豆芽菜用量的成本已经超过培养基其他部分的整体成本。因此，提高豆芽汁的获得量，降低发酵成本成为当前首要解决的问题。该研究拟通过煎煮和榨汁2种方法分别获取豆芽汁，以期提高豆芽汁的得率，为根瘤菌剂的生产节本增效。

菌剂的保存直接影响发酵后的有效活菌数。如果直接用发酵液常温保存，随着代谢产物的累积，根瘤菌剂仍是一种季节性产品。该课题组通过去营养化、低氧、渗透压保护及抑制剂抑制等方法使液体根瘤菌剂常温保存期能达到9个月（其有效活菌数达2亿CFU/mL以上），目前相关技术正在申请专利中。而对于工业生产，去营养化是最困难的一环，由于根瘤菌剂发酵均会产生大量粘液，如果单纯用离心或膜分离的方法，其能耗非常大，其成本也不低。根瘤菌不含荚膜，菌剂表面也不存在荚膜多糖，因此根瘤菌本身不具备粘稠性，其发酵液粘稠性主要来自于胞外多糖[6-7]。絮凝分离技术是一种新型的分离纯化技术，可用于发酵液的净化处理。该研究拟采用8种絮凝剂对根瘤菌发酵液进行处理，以期筛选出一种营养物质去除率高、絮凝菌体少，且对菌体无影响的絮凝剂，为紫云英根瘤菌的工业化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株中慢生华葵根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）13004#菌株，系中慢生根瘤菌属，由中国农科院菌种保藏中心引进。

1.1.2 培养基YMA培养基：甘露醇10 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCO30.2 g/L，Rh微量元素液4 mL/L（Rh微量元素液 ：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L），pH 值 6.8～7.0，豆芽汁1 000 mL。豆芽汁分两种形式，第一种为煎煮，200 g鲜豆芽加入1 000 mL水煮沸30 min后，纱布过滤；第二种为榨汁，200 g鲜豆芽用压榨机榨汁，弃芽渣，将榨汁液稀释至1 000 mL即得，每种设3次平行试验。种子培养基和计数培养基均为YMA培养基。

1.1.3 供试絮凝剂Al2(SO4)3·18H2O、CaCl2（分析纯，西陇化工股份有线公司）；阳离子聚丙烯酰胺（分子量800万～1 500万）、聚合氯化铝（天津市光复精细化工研究所）；Fe2(SO4)3，Na2HPO4·12H2O（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；壳聚糖（分析纯，上海博奥生物科技有限公司）。

1.1.4 主要仪器TV-1810型紫外-分光光度计（北京普析通用仪器有线公司）；TGL20M-II型高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；5424R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化、接种、培养和菌数测定将活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃，180 r/min培养18 h。后按1%接种量接入发酵培养基，同种培养条件，48 h后稀释平板计数。

1.2.2 絮凝试验根据发酵试验结果，取菌数最多的发酵液进行絮凝试验。考虑到pH值对细菌的影响，故将pH值维持与发酵液一致。根据文献报道[8-10]，选取各絮凝剂用量：壳聚糖0.03 g/mL；阳离子聚丙烯酰胺0.1 g/mL；聚合氯化铝0.05 g/mL；Al2(SO4)3·18H2O 2.5 g/mL ；Fe2(SO4)33 g/mL ；Na2HPO4·12H2O 2 g/mL ；CaCl23 g/mL。

1.2.3 絮凝操作取发酵液50 mL于100 mL烧杯中，快速搅拌同时缓慢加入絮凝剂，使其完全混合均匀，然后慢速搅拌10 min，搅拌结束后静置30 min。絮凝结束后，观察絮凝效果，同时将絮凝液低速（1 000 r/min）离心2 min，取上清液。

1.2.4 指标测定及方法（1）滤速测定：取上清液用中性滤纸过滤，并测定前2 min的滤液体积，计算滤速。（2）透光率测定：取上清液稀释10倍，以水为空白对照，在610 nm处测定透光率。（3）多糖含量的测定：取发酵液和絮凝离心分离的上清液采用DNS[11]法分别测定多糖含量，计算多糖去除率：多糖去除率（%）=（1-上清液多糖含量/发酵液多糖含量）×100。（4）蛋白质测定：取发酵液和絮凝离心分离上清液采用考马斯亮蓝法[12]分别测定蛋白质含量，计算蛋白去除率：蛋白去除率（%）=（1-上清液蛋白含量/发酵液蛋白含量）×100。（5）菌体含量测定：取发酵液和絮凝离心分离上清液采用稀释平板法计数，计算菌体收集率：菌体细胞含量（%）=（上清液菌体数/发酵液菌体数）×100。

1.2.5 抑菌试验将筛选出的絮凝剂用无菌水配制成絮凝剂使用浓度，经无菌过滤器（0.22 μm）过滤除菌，采用杯碟法进行抑菌活性测定，测定其是否对紫云英根瘤菌有抑制作用。

2 结果与分析

2.1 不同方式获取的豆芽汁对紫云英根瘤菌发酵水平的影响

从表1可以看出，添加豆芽汁后，根瘤菌的发酵水平得到极显著提升，其中榨汁组的菌数达百亿数量级，如此可观的发酵水平保证了工业发酵的质量，同时也证实了豆科植物发芽初期能分泌促进周围根瘤菌大量繁殖的物质。榨汁组与煎煮组的菌数差异也达极显著水平（P＜0.01），说明榨汁提取优于煎煮提取，更利于根瘤菌发酵，对于节省生产成本具有重要意义。

图1 不同方式获取的豆芽汁进行根瘤菌发酵获得的菌数

2.2 不同絮凝剂对发酵液的絮凝效果

添加絮凝剂后，经表观观察，发现阳离子聚丙烯酰胺和聚合氯化铝2种絮凝剂反应快速，均产生了大量絮凝团；硫酸铁絮凝剂也产生了少量絮凝团，而其他絮凝剂均未见明显絮凝反应。聚合氯化铝产生的絮凝团量最多，但粘壁现象十分严重，低转速离心未能使絮凝团沉积，不利于絮凝团的清洗；而阳离子聚丙烯酰胺粘壁现象少，1 000 r/min离心能使粘壁絮凝团沉积到下层。从表1可以看出，除壳聚糖外，高分子絮凝剂的絮凝效果明显优于低分子絮凝剂，这可能是因为壳聚糖经搅拌后仍难溶解，致使絮凝速率较慢，从而未表现出絮凝效果；而聚合氯化铝和阳离子聚丙烯酰胺2种絮凝剂絮凝效果非常明显，在蛋白去除率、多糖去除率、滤速和透光率方面也均明显优于其他絮凝剂，尤其是聚合氯化铝，蛋白去除率和多糖去除率分别达67.4%和84.7%，但其菌体回收率较低，仅37.9%，絮凝的同时也去除了大部分菌体，结合粘壁严重这一表观现象，表明聚合氯化铝并不适用通过絮凝分离营养物质和菌体。而阳离子聚丙烯酰胺，不但表现出了良好的蛋白去除率（60.7%）和多糖去除率（83.8%），而且具有不错的菌体回收率（60.3%）。综上可知，阳离子聚丙烯酰胺最适用于紫云英根瘤菌发酵液的菌体絮凝收集。

表1 不同絮凝剂絮凝效果的比较

2.3 絮凝剂的抑菌试验

研究的目的是利用絮凝剂絮凝特性来收集微生物，那么保证微生物的存活势必要对其抑菌性进行验证。从抑菌试验结果来看，该浓度的阳离子聚丙烯酰胺对紫云英根瘤菌未表现出明显的抑制效果。

3 讨 论

在发酵产业中，絮凝剂主要用于去除菌体、培养基、蛋白多糖等胶状物或是色素等，从而获得小分子代谢产物[13]。而该研究试图通过絮凝剂收集菌体，从试验结果来看，虽然絮凝分离对菌体造成一定的损失（阳离子聚丙烯酰胺损失率约40%），但因絮凝剂操作简单，能耗低，所用药剂和设备的价格低廉，相对于高速离心分离和高强度的膜分离仍具有成本优势。

目前关于絮凝剂的絮凝机理还没有完全弄清楚，现阶段被大多数人认可的絮凝机理为静电吸附理论、架桥絮凝理论或“表面覆盖”模式。絮凝是一个非常复杂的过程，单一的理论并不能解释所有现象[14]。阳离子聚丙烯酰胺是一种利用有机单体经化学聚合而成的有机高分子化合物，本身能溶于水，具有电解质行为。其絮凝机理是通过电中和使高分子链与多个胶体物质以化学键相结合，使用时加上高分子的吸附作用使大胶体颗粒沉降。当pH值为中性时，蛋白质一般带负电，而多糖也含有大量的阴离子基团，故阳离子聚丙烯酰胺在根瘤菌发酵液中能去除大量的胞外多糖和蛋白质。同时，根瘤菌本身不含荚膜，菌体表面电荷并不强（主要是细胞膜表面的糖蛋白），这可能是阳离子聚丙烯酰胺并未对菌体表现出很强絮凝活性的原因。

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Flocculating Efficiency of Rhizobium astragalus with Flocculants

WU Xiang-long，LEI Xiao，YI Shi-ming，LIU Huan，MENG Xiang-chi，LIU Yu-bo，ZENG Ao
（Hunan Institute of Microbiology, Changsha 410009, PRC）

Rhizobium fermentation produces a large amount of extracellular mucus, so the solid-liquid separation of mucus becomes very difficult. In order to reduce the difficulty in bacteria collection, 7 flocculants were used to treat fermentation broth at an optimized fermentation level and evaluate the flocculation effect through flocculation rate, protein removal rate, polysaccharide removal rate and supernatant microorganisms content in this study. The results showed that aluminium polychlorid had the highest flocculation rate, high protein removal rate and polysaccharide removal rate, but a low supernatant microorganisms content with the serious phenomenon of adhering to wall; and cationic polyacrylamide performed a good effect of supernatant microorganisms content and polysaccharide removal rate, with a little wall-adhering phenomenon. In summary, the cationic polyacrylamide was the most suitable flocculant to Rhizobium astragalus for the solid-liquid separation of mucus.

Rhizobium astragalus; flocculant; polysaccharide; flocculation

Q939.114

A

1006-060X（2017）09-0010-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.009.003

2017-07-18

国家自然科学基金（31501698）

吴湘龙（1976-），男，广东揭阳市人，初级农艺师，主要从事农业微生物研究。

曾 奥

（责任编辑：成 平）