反义缺氧诱导因子-1α对人膀胱癌细胞生长的影响①

战 鹏 范海涛 张 明 冯树强 郑红淑

(吉林大学第二医院泌尿外科，长春 130041)

反义缺氧诱导因子-1α对人膀胱癌细胞生长的影响①

战 鹏 范海涛 张 明 冯树强 郑红淑

(吉林大学第二医院泌尿外科，长春 130041)

膀胱癌是泌尿系统发病率和病死率均居首位的恶性实体肿瘤。近年研究发现人类绝大多数恶性实体肿瘤，其内存在低氧微环境，肿瘤细胞会激活一系列相关分子信号传导途径以适应缺氧微环境，同时增强肿瘤细胞自身的侵袭性和对放化疗的抗拒性，致使疗效降低，其中缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)起到了更为关键的枢纽作用。近期有关HIF-1α作为癌基因在人体多种恶性实体肿瘤中过表达和针对其用药治疗的有效性报道较多[1,2]。但在以HIF-1α为靶点的膀胱癌研究治疗却鲜见报道。为此我们通过反义寡核苷酸技术，抑制膀胱癌细胞中HIF-1α表达，观察反义HIF-1α(AS-HIF-1α)对癌细胞生长的影响，探讨其作为癌基因用于人膀胱癌靶向分子治疗的可能性和有效性。

1 材料与方法

1.1实验材料 反义和随机对照寡核苷酸购自上海吉玛制药技术有限公司，反义HIF-1α(AS-HIF-1α)为5′-GCCTCTGTGGGTTTGCCTAGTGTTTC，随机对照序列为5′-ATTGGTAAGGATGACAGTGTA-ATTTC。在Genbank中行Blastn检测，证实ASODN与任何其他已知哺乳动物基因无匹配。DMEM和脂质体Lipofecta minc2000购自Gibco公司，Trizol试剂盒购自Invitrogen公司。人膀胱癌细胞株T24购自中国科学院上海细胞所。

1.2实验方法 ①T24细胞培养和转染：用含10%的灭活胎标准小牛血清RDMI1640培养液，在37℃，2%CO2卵育箱内贴壁培养，直到T24细胞成对数生长，细胞克隆并筛选。用Lipofectaminc2000，按照说明书所述方法分3组转染细胞。即AS-HIF-1α转染组，转染无义序列组和空白对照组。②RNA提取及Western blot检测:按照Trizol试剂盒说明书提取转染细胞总RNA，采用Western blot检测HIF-1α表达量。③检测T24细胞增殖能力，细胞周期和凋亡变化 在细胞被转染72 h后，用MTT比色法测定细胞增殖率，FCM鉴定细胞凋亡率和细胞周期。

2 结果

2.1HIF-1α在3组细胞中的表达 Western blot法检测结果(见图1)显示，AS-HIF-1α转染组的HIF-1α表达明显降低，而转染无义序列组和对照组的HIF-1α表达明显上调。膀胱癌细胞中的HIF-1α表达明显高于正常细胞，提示HIF-1α可能作为一种致癌基因参与了膀胱癌发生发展的过程。

2.2HIF-1α对T24细胞增殖的作用MTT比色法 分别检测了3组细胞的增殖率，结果(见图2)依次为，AS-HIF-1α组57.4%，转染无义序列组94.8%，对照组100%。上述3组间分别比较，差异均具有显著统计学意义(P<0.01)，而转染无义序列组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，AS-HIF-1α通过下调肿瘤细胞HIF-1α表达抑制体外T24细胞增殖的作用，为今后临床膀胱癌的治疗提供了一定的实验依据。

2.3HIF-1α对T24细胞周期变化和凋亡的影响 FCM分析结果(见图3)显示，AS-HIF-1α组，转染无义序列组和对照组的G0/G1期细胞分别是59.2%，48.7% 和45.9%；S期分别是21.5%，32.6%和35.8%。AS-HIF-1α组S期细胞比例减少，细胞大多阻滞在G0/G1期，对照组和无义序列组几乎无变化(P>0.05)。AS-HIF-1α组与对照组和无义序列组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，AS-HIF-1α组，对照组和无义序列组的细胞凋亡率依次是15.9%，2.4 %和3.1%。AS-HIF-1α组细胞凋亡率明显高于其他两组，差异比较有显著统计学意义(P<0.01),而对照组和无义序列组比较，差异则无统计学意义(P>0.05)。

图1 HIF-1α在不同3组中的表达(SP×400)Fig.1 Expression of HIF-1α in different three groups(SP×400)

图2 MTT法检测T24细胞的增殖率Fig.2 Detect proliferation rate of T24 cells by MTT

3 讨论

据流行病学资料统计，膀胱癌虽可发生在任何年龄，但其发病年龄高峰是在中年以后，发病率随年龄增加而上升，并且男性多于女性。膀胱癌的特点是发病率高，治疗后易复发，复发后恶性程度增高[3,4]。因此早期诊断，提高疗效，预防复发对膀胱癌来说既是难点也是热点。随着对肿瘤分子生物学研究的深入和癌基因学说的确立，癌基因检测和针对癌基因的分子靶向治疗成为目前肿瘤研究与治疗的热点之一。最近几年的研究发现，HIF-1α在人体多种恶性实体肿瘤中过表达，并被证实既能促进肿瘤本身发生发展也与化疗耐药密切相关[3，5]。提示HIF-1α在肿瘤中的致癌作用与生物学行为具有普遍性。Nurwidya等[6]报道在人体几乎所有恶性实体肿瘤中检测到了一种类似的致癌因子——缺氧诱导因子-1α，该因子的表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关。上述研究结果使我们有理由推测，应用HIF-1α的干扰物或阻碍物，通过转染肿瘤细胞可能有助于抑制肿瘤的生长转移，这一作用可能是通过降解癌基因蛋白，阻断肿瘤分子信号传导通路实现的[7]。

反义寡核苷酸技术是一门业已发展成熟的肿瘤生物治疗方法，已被推荐用于癌症、病毒感染和遗传性疾病的治疗[8-10]。本研究用反义技术，针对HIF-1α设计其反义寡核苷酸，观察AS-HIF-1α对人膀胱癌T24细胞株的作用。结果提示，抑制T24细胞中过表达的HIF-1α后，该细胞增殖能力明显下降，凋亡指数显著上升，以及S期细胞比例减少。提示HIF-1α极有可能作为一种癌基因参与了临床膀胱癌发生发展的过程。这使我们有理由推测对HIF-1α高表达的膀胱癌T24细胞，能够通过反义技术有效抑制HIF-1α的表达，这为拓展临床膀胱癌更加有效的靶向分子治疗提供了实验依据和新的思路。

图3 FCM检测T24细胞周期和凋亡率Fig.3 Detect cell cycle and apoptosis rate of T24 by FCM

[1] Semeza GL.Hypoxia-inducible factors:mediators of cancer progression and targets for cancer therapy [J].Trends Phar-macol Sci,2012,33(4):207-214.

[2] Sun Y,Guan Z,Liang L,etal.HIF-1α/MDR1 pathway confers chemoresistance to cisplatin in bladder cancer.[J].Oncol Rep,2016,35(3):1549-1556.

[3] Sun YW,Xuan G,Shu GA,etal.Correlation of tumor relapse and elevated expression of survivin and vascular endothelial growth factor in superficial bladder transitional cell carcinoma[J].Gene Mol Res,2013,12 (2) :1045-1053.

[4] Miglietta G,Gouda AS,Cogoi S,etal.Nucleic acid targeted therapy:G4 oligonucleotides downregulate hras in bladder cancer cells through a decoy mechanism [J].ACS Med Chem Lett,2015,6(12):1179-1183.

[5] Soni S,Padwad YS.HIF-1α in cancer therapy:two decade long story of a transcription factor[J].Acta Oncol,2017,56(4):503-515.

[6] Nurwidya F,Takahashi F,minakata K,etal.From tumor hypoxia to cancer progression:the implications of hypoxia-inducible factor-1 expression in cancers[J].Anat Cell Biol,2012,45 (2):73-78.

[7] Guan Z,Ding C,Du Y,etal.HAF drives the switch of HIF-1α to HIF-2α by activating the NF-κB pathway,leading to malignant behavior of T24 bladder cancer cells[J].Int J Oncol,2014,44(2):393-402.

[8] Li H,Quan J,Zhang M,etal.Lipid-albumin nanoparticles (LAN) for therapeutic delivery of antisense oligo-nucleotide against HIF-1α[J].Mol Pharm,2016,13 (7) :2555-2562.

[9] 周燕琼，张艳美，高分飞，等.反义寡核苷酸抑制早期生长反应基因-1表达对内皮细胞缺氧复氧损伤的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2015,20(1)：14-18.

[10] Studzińska S,Bocian S,Siecińska L,etal.Application of phenyl-based stationary phases for the study of retention and separation of oligonucleotides [J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2017,1060:36-43.

[收稿2017-06-13 修回2017-09-05]

(编辑 许四平 刘格格)

①本文为吉林省自然科学基金项目(20150101195JC)。

R737.14

A

1000-484X(2017)10-1557-02

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.024

战 鹏(1985年-)，男，硕士，医师，主要从事泌尿系统肿瘤疾病方面研究。

及指导教师：张 明(1963年-)，男，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事泌尿系统肿瘤疾病方面的研究,E-mail：zhang ming196312@163.com。