一测多评法用于香加皮提取物中7种C21甾体皂苷成分的含量测定

李瑞雪　吴飞　张继全

[摘要] 目的 以一测多评法建立香加皮提取物中7种C21甾体皂苷成分的高效液相色谱分析方法。 方法 采用Capcell Pak C18色谱柱，流动相乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脱，检测波长263 nm，以杠柳苷A（PSA）为内参物，建立其与杠柳苷K（PSK）、杠柳苷R（WJ53）、杠柳苷E（WJ521）、杠柳苷D（PSD）、杠柳苷Q（WJ33）和杠柳苷O（WJ32）的相对校正因子，并进行含量计算，实现一测多评，并将一测多评法测定结果与外标法测定结果对比，验证一测多评法的准确性。 结果 PSA与PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的相对校正因子分别为0.867、0.867、0.847、0.994、0.922和1.029。采用校正因子计算的含量值与外标法实测值之间没有显著性差异。 结论 该方法准确可靠，简便可行，可作为香加皮提取物中间体多指标成分测定的质量控制方法。

[关键词] 香加皮提取物；C21甾体皂苷；一测多评法；相对校正因子；杠柳苷A；高效液相色谱法；外标法

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（c）-0021-04

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography method for quantitative analysis of seven C21 steroidal saponins in Cortex periplocae extract by quantitative analysis of multi-components by single-marker. Methods The high performance liquid chromatography analysis was performed on a Capcell Pak C18 column with the detection wavelength at 263 nm. The mobile phase was water containing 0.2% formic acid and acetonitrile in the gradient mode. Periploside C （PSA） was used as the internal marker to establish relative correction factors between PSA and periploside K （PSK）， periploside R （WJ53）， periploside E （WJ521）， periploside D （PSD）， periploside Q （WJ33）， periploside O （WJ32）， and the relative correction factors would be used in the calculation of their contents. The result of quantitative analysis of multi-components by single-marker was compared with external standard method， so as to verify the accuracy of quantitative analysis of multi-components by single-marker. Results The relative correction factors between PSA and PSK， WJ53， WJ521， PSD， WJ33， WJ32 was 0.867， 0.867， 0.847， 0.994， 0.922 and 1.029， respectively. The content values calculated by correction factors and measured values of external standard method did not show significant differences. Conclusion The established quantitative analysis of multi-components by single-marker method is feasible， accurate， simple and can be used as a method for the determination of multi-component indexes in the extract of Cortex periplocae.

[Key words] Cortex periplocae extract； C21 steroidal saponins； Quantitative analysis on multi-components by single-marker； Relative correction factor； Periploside C； High performance liquid chromatography； External standard method

自2006年首次提出以來，一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）迅速成为中药复杂体系多指标同时定量测定的重要手段，该法可有效节约成本，提高检测效率，也日渐成为中药质量评价的新模式[1-6]。香加皮中C21甾体皂苷的药理活性被广泛研究[7-13]，主要有抗炎、抗癌、免疫调节、细胞分化诱导作用以及升白细胞作用。而C21甾体苷类成分中的杠柳苷A（PSA）是活性最明确且在香加皮提取物中含量最高的成分，因此本研究将PSA作为内参物，建立与其他6个已知结构成分的相对校正因子（RCF），用于7个C21甾体皂苷类成分的同时测定，并用于香加皮甾体皂苷类活性部位的质量研究，进一步将香加皮提取物入药，可减少服从剂量，提高患者依从性。endprint

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1200型和1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Capcell pak C18色谱柱[4.6 mm×250 mm，5 μm，资生堂（中国）投资有限公司]；Promosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，博纳艾杰尔科技有限公司）；Phenomenex Luna 5 μm C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国菲罗门公司）；Kromasil 100-5C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，瑞典AKZO NOBEL公司）；XP205型电子分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司）；SK5200H超声清洗仪（上海科导超声仪器有限公司），Milli-Q型超纯水制备仪（密理博中国有限公司）。

1.2 材料与试剂

香加皮提取物5批（自制，制备方法：取香加皮药材，10倍量水提除杂2次，70%乙醇醇提3次，合并提取液浓缩至无醇，20%醇沉取沉淀，35%醇沉取沉淀，将沉淀用70%乙醇溶解，环己烷萃取3次，过大孔树脂柱，收集95%部分洗脱液，60%醇沉，沉淀过滤、干燥，即得。批号分别为20150706、2150713、20150831、20160314和20160317）； PSA、杠柳苷K（PSK）、杠柳苷R（WJ53）、杠柳苷E（WJ521）、杠柳苷D（PSD）、杠柳苷Q（WJ33）、杠柳苷O（WJ32）对照品（批号均为20160316，由中国科学院上海药物研究所提供，纯度分别为98.16%、98.49%、98.09%、99.04%、98.13%、98.77%和95.86%）；甲醇、乙醇、甲酸（均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司），蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Capcell pak C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液；梯度洗脱0～18 min（80∶20～92∶8）；柱温30℃；流速1.0 mL/min；检测波长为263 nm。7个对照品和样品HPLC图谱见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA对照品适量于25 mL量瓶中，加甲醇超声溶解并定容。各取1 mL对照品溶液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖匀，得浓度分别为0.099 68、0.100 28、0.104 48、0.101 68、0.099 64、0.100 80、0.102 56 mg/mL的对照品混标溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取香加皮提取物（批号：20150706）20 mg于5 mL容量瓶，加无水乙醇超声5 min溶解，定容，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 分别吸取“2.1.2”项下的混合对照品溶液1、2、5、10、20、30、50 μL，按色谱条件测定，以对照品峰面积（Y）对进样质量（X）进行线性回归，得回归方程和线性范围见表1。结果表明在0.1～5.1 μg范围内，7个成分的峰面积与进样质量线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下的混合对照品溶液10 μL，按上述色谱条件进行分析，连续进样6次，记录各成分的色谱峰，PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA峰面积的RSD分别为1.33%、0.16%、0.32%、0.21%、0.27%、0.34%和0.27%，表明测定精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取香加皮提取物（批号：20150706）20 mg，精密称定，平行6份，按“2.1.3”项下制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，测得PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA的平均含量分别为8.49、8.54、22.92、41.82、32.56、48.65、485.91 mg/g，RSD分别为2.40%、1.76%、1.66%、1.21%、1.22%、1.67%和1.73%，表明测定方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取香加皮提取物（批号：20150706）20 mg，精密称定，按“2.1.3”项下制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进样，记录峰面积，7个成分峰面积的RSD分别为3.43%、1.39%、1.84%、1.27%、1.14%、0.99%和0.48%，表明室温放置条件下12 h内供试品溶液稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取香加皮提取物（批号：20150706）9份，各约10 mg，精密称定，分别按已知含量的50%、100%、150% 3个水平加入“2.1.2”项下的单一对照品溶液，按“2.1.3”项下处理样品，在上述色谱条件下进行测定，计算加样回收率。PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA的平均加样回收率分别为102.08%、102.37%、98.21%、104.61%、102.90%、103.52%和104.82%，RSD分别为3.96%、3.67%、3.07%、3.86%、3.73%、2.52%和2.82%。结果表明测定方法的回收率均符合要求。

2.2 校正因子计算

取“2.1.2”项下的混合对照品溶液1、2、5、10、20、30、50 μL，按色谱条件测定，以PSA为内参物，按公式f1/2=f1/f2=A1/C1×C2/A2计算PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的RCF。见表2。

2.3 系统适用性考察

考察了Agilent 1200型HPLC（a）和Agilent 1260型HPLC（b）液相色谱系统，以及4根不同的色谱柱：①Capcell Pak C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、②Promosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、③Phenomenex Luna 5 μm C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、④Kromasil 100-5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。取“2.1.2”项下混标溶液，进样10 μL，按上述液相条件进行测定，以PSA为内参物，计算PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的RCF，结果内参物与各成分的RCF的RSD值在3%以内，表明不同色谱柱和不同液相系统时，方法的重复性良好。见表3。endprint

2.4 待测组分色谱峰的定位

计算各待测组分与内参物PSA的相对保留值（r）作为色谱峰定位标准。各成分相对保留值见表4。

2.5 一测多评法与外标法测定结果的比较

取5批香加皮提取物粉末（批号分别为20150706、 2150713、20150831、20160314和20160317）约20 mg，精密称定，按“2.1.3”项下制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定。以PSA为内参物，采用一测多评法计算PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的含量，同时采用外标法进行计算含量。两种方法测得的PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33和WJ32的含量没有显著性差异。见表5。

3 讨论

以PSA为内参物，建立了PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32与PSA的RCF，分别为0.867、0.867、0.847、 0.994、0.922和1.029，经过方法学和系统适用性验证符合要求。采用此方法测定5批香加皮中7种成分皂苷，相对误差小，结果与外标法无显著性差别。本研究所建立的香加皮中C21甾体皂苷类成分的一测多评法与外标法[14-15]同时检测多种成分相比较，具有操作简单、快捷高效的特点，适合应用于中药多成分同时检测的质量控制，已经用于准确评价制剂中间体的质量，将为后续制剂工艺研究和制剂质量标准等相关研究奠定重要基础。

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（收稿日期：2017-06-14 本文编辑：张瑜杰）endprint