反相高效液相色谱法在补骨脂提取物3种主要成分含量测定中的应用

李建梅　周凡　希尔艾力·吐尔逊

[摘要] 目的 采用反相高效液相色谱法，建立同时测定补骨脂提取物中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚含量的方法。 方法 采用Epic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：甲醇-水，梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长250 nm。 结果 该法测定补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚分别在0.0563～0.3379、0.0523～0.3139、0.1280～0.7680 μg范围内线性关系良好，相关系数均为0.9999。平均加样回收率分别为100.66%（n=6）、RSD=1.77%，100.43%（n=6）、RSD=1.45%和99.41%（n=6）、RSD=1.63%。 结论 本方法简便、准确、灵敏、重复性好，可作为补骨脂提取物中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的含量控制方法。

[关键词] 补骨脂；补骨脂素；异补骨脂素；补骨脂酚；反相高效液相色谱

[中图分类号] R969 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（c）-0012-04

[Abstract] Objective To determine psoralen， isopsoralen and bakuchiol from the extract of Psoralea corylifolia by RP-HPLC. Methods The contents of paoralen， isopsoralen and bakuchiol were determined on the Epic C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column， with methanol： water in gradient elution manner. The flow rate was 1.0 mL/min， the column temperature was maintained at 30℃， and the detection wavelength was set up at 250 nm. Results The linear ranges of paoralen， isopsoralen and bakuchiol were 0.0563-0.3379， 0.0523-0.3139 and 0.1280-0.7680 μg （r=0.9999）. The average recovery of paoralen， isopsoralen and bakuchiol were 100.66%， 100.43% and 99.41%， RSD were 1.77%， 1.45% and 1.63% （n=6）. Conclusion The method is convenient， accurate sensitive and repeatable， and can be used in the content control method of psoralen， isopsoralen and bakuchiol in extract of Psoralea corylifolia.

[Key words] Psoralea corylifolia L.； Psoralen； Isopsoralen； Bakuchiol； RP-HPLC

補骨脂是中医、维吾尔医常用药材，临床应用广泛。补骨脂为豆科植物补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果实。维吾尔医认为本品性二级干热，味辛、苦。功能生干生热，清除异常黏液质，赤肤发泡，增加色素，净血解毒，祛风止痒，燥湿除疹，杀驱肠虫等。主治湿寒性或黏液质性疾病，如白癜风，麻风，皮肤瘙痒，各类湿疹，肠道生虫等。中医认为补骨脂味辛、苦、温，归肾、脾经，具有温肾助阳，纳气平喘，温脾止泻之功效；外用消风祛斑。用于肾阳不足，阳痿遗精，遗尿尿频，腰膝疼痛，肾虚作喘，五更泄泻；外治用于皮肤病和白癜风，斑秃等[1-2]。《中国药典》（2015版）中收载的含补骨脂的中成药就有40种，临床医师处方中应用补骨脂更广泛，《卫生部药品标准-维吾尔药分册》收载的含补骨脂的白癜风治疗制剂有9种[2]。

补骨脂酚含量约占补骨脂药材的5%，是含量最多的成分，补骨脂素和异补骨脂素是补骨脂药材的主要活性成分，因此，建立简便、快速、准确、重现性好，且同时能够测定补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚含量的方法，可用于补骨脂药材及制剂的质量控制。成药制剂和临床处方中补骨脂常采用乙醇提取或水提取[3-8]，本实验采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对补骨脂乙醇提取和水提取物中的补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚3种主要成分同时进行定量检测[9-13]，为补骨脂药材及提取物质量的综合评价提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国Waters e2695高效液相色谱仪及化学工作站（美国沃特斯公司）；Waters 2996二极管阵列检测器，Empower数据采集系统；Milli-Q超纯水纯化系统（18 MΩ，Millipore公司）；SGT7200HBT型超声清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；Sartorius LA120s电子天平（德国赛多利斯）；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；PTHW调温电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）；600 g摇摆式告诉万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；DHG09140A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；SB-1000数显恒温水浴锅（东京理化器械株式会社）；N-1000旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；DLSB-5/10低温冷却循环泵（巩义市京华仪器有限责任公司）。

1.2 试药

补骨脂素对照品（南京景竹生物科技有限公司，HPLC>98%，批号：JZ16010702）；异补骨脂素对照品（南京景竹生物科技有限公司，HPLC>98%，批号：JZ16011401）；补骨脂酚对照品（南京景竹生物科技有限公司，HPLC>98%，批号：JZ16030702）；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为超纯水；磷酸、甲酸（分析纯）；补骨脂药材（新疆奇康哈博维药有限责任公司提供，产地陕西，批号：20151027），经过新疆维吾尔自治区维吾尔医医院药剂科艾尼瓦尔主任药师鉴定，为豆科植物补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果实。endprint

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚对照品适量，置于25 mL棕色容量瓶中，分别加甲醇制成0.3520、0.5030和0.8000 mg/mL的对照品储备液。精密吸取补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚对照品储备液各2.0、1.3和2.0 mL，同时置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，制成每毫升溶液含28.16 μg补骨脂素、26.16 μg异补骨脂素和64.00 μg补骨脂酚的混合对照品溶液。

2.2 补骨脂提取物的制备

取补骨脂，加10倍量水，回流提取3次，1 h/次，合并提取液，60℃减压浓缩至相对密度为1.12～1.15的稠浸膏，于60℃真空干燥箱内减压干燥，制成干浸膏，粉碎过100目筛，备用（批号：170119）；同法制备补骨脂乙醇提取物，备用（批号：170208）。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取补骨脂水提取物约0.10 g，置于25 mL的棕色量瓶中，加甲醇溶液20 mL，超声处理（59 kHz）30 min，定容至刻度，摇匀，过滤。

精密称取补骨脂醇提取物约0.10 g，置于50 mL的棕色量瓶中，加甲醇溶液45 mL，超声处理（59 kHz）30 min，定容至刻度，摇匀，再精密吸取1～10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过滤[1-4]。

2.4 色谱条件

色谱柱：Epic C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B）梯度洗脱：0～10 min（58%～61%A），10～11 min（61%～95%A），11～21 min（95%～95%A）；检测波长：250 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30℃。

2.5 系统适用性实验

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按“2.4”项下色谱条件进行测定，色谱图见图1。结果表明，在此色谱条件下，补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚均与样品中其他组分色谱峰基线分离，理论塔板数均大于4000。

2.6 线性关系考察

精密量取“2.1”项下补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚混合对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL，分别注入液相色谱仪，以进样量（μg）为横坐标，对照品峰面积为纵坐标进行回归，得回归方程：y=6 333 902.19x-38 403.13，r=0.999 9；y=7 210 706.64x-38 048.93，r=0.999 9；y = 2 624 543.75 x-60 488.60，r=0.999 9。结果表明，补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚分别在0.05630～0.3379、0.0523～0.3139和0.1280～0.7680 μg范围内，进样量与峰面积线性关系良好。

2.7 精密度试验

精密吸取浓度为28.16 μg/L的补骨脂素、26.16 μg/L的异补骨脂素和64.00 μg/L的补骨脂酚混合对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，重复进样6次，记录各自峰面积，补骨脂素RSD为0.9600%，异补骨脂素RSD为0.58%，补骨脂酚RSD为1.06%。表明精密度良好。

2.8 重复性试验

取补骨脂水提取物（批号：170119），精密称取约0.10 g，按上述“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，照供试品测定方法测定补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的含量，结果6份样品进样补骨脂素平均含量为3.01 mg/g，RSD=0.65%，异补骨脂素平均含量为2.25 mg/g，RSD=0.82%（n=6），补骨脂酚平均含量为14.65 mg/g，RSD=1.59%（n=6）。表明本法重复性良好。

2.9 稳定性试验

取补骨脂水提取物（批号：170119），精密称取约0.10 g，按上述“2.3”项下方法制备供试品溶液，在相同的色谱条件下分别于0、2、4、6、12、24 h进样10 μL进行测定，测定补骨脂素峰面积RSD为0.85%，异补骨脂素峰面积RSD为1.19%，补骨脂酚峰面积RSD为1.46%（n=6）。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.10 加样回收率试验

采用标准添加法测定回收率。精密称取补骨脂水提物（批号：170119）6份，每份约0.05 g，放入25 mL容量瓶中，分别加入浓度为0.352 mg/mL的补骨脂素对照品溶液0.4 mL，0.503 mg/mL的异补骨脂素对照品溶液0.2 mL，0.800 mg/mL的补骨脂酚照品溶液0.8 mL，加甲醇溶液适量超声提取30 min后定容，平行制备6份供试品溶液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，测定，补骨脂素平均回收率分别为100.66%（n=6），RSD=1.77%，异补骨脂素平均回收率分别为100.43%（n=6），RSD=1.45%，补骨脂酚平均回收率分别为99.41%（n=6），RSD=1.63%，结果见表1。本方法具有良好的准确性。

2.11 样品测定结果

准确称取补骨脂水提物（批号：170119）和醇提物（批号：170208）各约0.10 g，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，进样测定分析并计算含量，结果见表2。

3 讨论

补骨脂中化学成分较多，补骨脂酚是补骨脂药材中含量最多的成分，补骨脂素和异补骨脂素是补骨脂药材的主要活性成分，而这些成分主要存在于醇提部位中。研究报道对补骨脂的含量测定研究多为对原药材或成方制剂中补骨脂素和异补骨脂素进行的检测，鲜见采用RP-HPLC对补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚进行同时测定的研究，而本实验为首次对补骨脂水提和醇提物中该3种成分进行测定。本实验采用RP-HPLC，建立补骨脂药材中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚3种主要成分同时测定的方法，并比较两種提取物中3种成分的含量差异，为后期临床应用及新药开发提供数据基础，为补骨脂药材及其制剂的质量控制提供简便、快速、准确、重现性好的测定方法。endprint

利用二极管阵列检测器在线采集3个成分200～400 nm的紫外光谱，综合考虑在250 nm处3个成分均有较好的吸收，并且极限平稳，响应值相对较高，最终选择250 nm作为补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚同时测定的检测波长。在流动相的选择上，参考《中国药典》2015年版一部中补骨脂含量测定项[1]所使用的流动相，并在此基础上加以调整，以甲醇-水梯度洗脱的条件进行分析，达到分离测定的目的。样品处理方法分别考察了回流法和超声提取法，同时对甲醇、乙醇、50%甲醇等提取溶剂与提取时间进行考察，综合考察结果以甲醇超声处理30 min所得样品出峰数目始终，干扰峰少，分离度好，响应值较高。

补骨脂素与异补骨脂素在常温状态下为针状结晶，而补骨脂酚为油狀液体，三者均可溶于乙醇。文献报道不同提取或炮制方式对补骨脂的成分和药效有影响[14-18]。本研究通过实验对比发现，补骨脂醇提物中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚含量均高于水提物中含量，其中补骨脂酚在醇提物中含量是水提物中含量的近15倍。补骨脂及其复方制剂长期超剂量服用存在一定的毒性，包括肝毒性和视网膜毒性，且有动物实验表明补骨脂酚对小鼠肾脏损害有较强的选择性[19-20]。本课题组前期对补骨脂水提取物的急性毒性实验结果显示，其对小鼠血液学有一定影响，其中高剂量组干细胞出现水肿，主要在中央静脉周围，说明对小鼠具有一定的肝毒性[17]。鉴于以上文献和实验研究，本课题组将在后期毒性试验结果中进一步研究比较补骨脂药材两种提取物的差异性。

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（收稿日期：2017-06-25 本文编辑：李亚聪）endprint