延边地区牛卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查

田万年 ， 薛书江 ， 贾立军 ， 张守发， 李国江

(1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101；2. 预防兽医学吉林省重点实验室，吉林 吉林 132101；3. 延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

延边地区牛卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查

田万年1,2， 薛书江3， 贾立军3， 张守发3， 李国江1,2

(1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101；2. 预防兽医学吉林省重点实验室，吉林 吉林 132101；3. 延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

为了解牛卵形巴贝斯虫病在吉林省延边地区流行情况，本试验应用PCR方法对珲春地区190份牛的血液样本进行牛巴贝斯虫病的分子流行病学调查，并与血液涂片染色镜检法进行了比较。结果该地区牛巴贝斯虫病的PCR方法检测阳性率为30.52%，而血涂片染色镜检法的阳性率为11.05%。不同地区和不同饲养方式间牛卵形巴贝斯虫感染率差异显著(P<0.05)。遗传进化分析显示，吉林省延边地区牛卵形巴贝斯虫与日本分离株处于同一分支，而区别于河南和韩国分离株。调查表明，吉林省延边地区是牛卵形巴贝斯虫病的流行地区。

卵形巴贝斯虫 ； PCR ； 血液涂片镜检法 ； 分子流行病学调查

牛的卵形巴贝斯虫病(Babesia ovata)是由巴贝斯科巴贝斯属的卵形巴贝斯虫寄生于牛红细胞内所引起的寄生虫病[1]。病牛多表现为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，多引起死亡[2-3]。我国于1986年在河南省卢氏县牛体内发现本病，随后1994年，在甘肃张家川回族自治县牛体内分离到卵形巴贝斯虫[4]。目前国内对牛卵形巴贝斯虫研究报道较少，罗建勋等[5]对牛的巴贝斯虫18S rRNA基因序列进行了比较研究，动物感染方式采用人工感染，有关自然感染条件下牛卵形巴贝斯虫分子分类学研究尚未见报道。本试验通过对吉林省延边地区自然感染的牛卵形巴贝斯虫病进行分子流行病学调查，并进行卵形巴贝斯虫的分类鉴定，为吉林省延边地区牛卵形巴贝斯虫病的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 血液样本采自吉林省延边州珲春80份、汪清45份、安图30份和敦化35份4个地区共190份牛抗凝血，同时制作血液涂片，供染色镜检。

1.2 主要试剂 全血DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2000 DNA Marker等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 血液样本PCR检测

1.3.1 引物的设计与合成 根据GenBank上登录的牛卵形巴贝斯虫18S rRNA基因序列(AY081192)，利用Primer Premier 5.0软件设计了1对引物。引物P1: 5′-ATTTCAGCCCTTTGGCTTTTCC-3′, P2: 5′-TAGGAGCGACGGGCGGTGTGTA-3′，扩增预期片段大小为954 bp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.3.2 牛卵形巴贝斯虫DNA标准模板的制备 按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA，抽提的DNA用50 μL TE溶解，-20 ℃保存备用。

1.3.3 PCR反应条件 以提取的牛卵形巴贝斯虫DNA为模板，PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 卵形巴贝斯虫18S rRNA基因克隆及序列分析 卵形巴贝斯虫18S rRNA基因PCR阳性样品经琼脂糖凝胶电泳后，进行切胶回收、纯化，纯化后送往宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。测序结果与GenBank中登录的卵形巴贝斯虫、巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫18S rRNA基因序列为基础，建立卵形巴贝斯虫的系统进化树。序列依次为牛卵形巴贝斯虫(LC125457、AY081192、AY603402、AY603401)、牛巴贝斯虫(HQ264111、AY603398)、牛双芽巴贝斯虫(AY603400、KM046917)。瑟氏泰勒虫(TQ723015、EU083803、EU083804、AB016074)、环形泰勒虫(AY260172、EU083801)。

1.5 统计分析 运用SPSS 19.0 软件对190份PCR检测样本分别进行不同区域、不同饲养方式和不同年龄进行统计学分析。

2 结果

2.1 血液涂片染色镜检结果 190份血涂片经姬姆萨染色镜检，有21份为阳性，阳性率11.05%。血液涂片姬姆萨染色镜检结果见图1。

图1 血液涂片姬姆萨染色镜检结果

2.2 PCR检测 190份血液样本经PCR检测，经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，出现954 bp的特异性DNA条带(见图2)，阳性率为30.52%。

图2 部分血液样本PCR检测结果

M：DL-2 000 DNA Marker； 1～19：被检血液样本PCR产物； 20：空白对照

2.3 不同地区牛感染卵形巴贝斯虫情况 采用PCR方法对分别采自珲春、汪清、安图和敦化4个地区的190份血液样本进行牛卵形巴贝斯虫感染情况的比较，其结果见表1。从表1可见，不同地区牛均可感染卵形巴贝斯虫病。经统计学分析，珲春卵形巴贝斯虫感染率显著高于其他3个地区，差异显著(P<0.05)。

2.4 不同年龄牛感染卵形巴贝斯虫情况 将PCR检测的190份牛血液样本的检测结果，按不同年龄分组进行比较，其结果见表2。

表1 不同地区牛感染卵形巴贝斯虫的情况

*：平均感染率

表2 不同年龄牛感染卵形巴贝斯虫的情况

*：平均感染率

从表2可见，各年龄段的牛均可感染卵形巴贝斯虫。经统计学分析，不同年龄段之间牛卵形巴贝斯虫感染率差异不显著(P>0.05)。

2.5 不同饲养方式牛感染卵形巴贝斯虫情况 将PCR检测的190份牛血液样本的检测结果，按不同饲养方式分组进行比较，其结果见表3。

表3 不同饲养方式牛感染卵形巴贝斯虫的情况

*：平均感染率

从表3可见，不同饲养方式的牛均感染卵形巴贝斯虫。统计学分析表明，不同饲养方式牛卵形巴贝斯虫感染率差异显著(P<0.05)。

2.6 珲春地区牛卵形巴贝斯虫18S rRNA序列分析及遗传进化树构建 将本试验测得牛卵形巴贝斯虫序列与GenBank登录的巴贝斯虫和泰勒虫序列进行对比分析，应用DNAMAN软件构建系统发育树，进行系统发育分析(见图3)。结果显示，本次测序获得吉林珲春地区牛卵形巴贝斯虫序列，B.ovataJilin 分离株与日本分离株亲缘关系较近，而区别于国内河南分离株、韩国分离株。牛卵形巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫亲缘关系较近，处在同一分支上，与牛巴贝斯虫亲缘关系较远。

图3 基于巴贝斯虫和泰勒虫18S rRNA基因序列的系统进化树

3 讨论

目前我国对牛卵形巴贝斯虫病的诊断主要通过临床症状和血液涂片镜检的常规诊断方法确诊本病[6]，但由于染色剂及相似病原体等人为因素影响镜检结果的判定，不适于对该病的早期诊断。牛卵形巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫在形态较相似，在显微镜下很难进行区别，不能反映动物感染的真实情况[7]。PCR方法是一种特异性强、敏感性高的诊断方法，已广泛应用到梨形虫病流行病调查研究[8-9]。本试验采用PCR方法对吉林省190份牛血液样本进行了检测。调查结果显示，PCR方法阳性率为30.52%，而血液涂片染色镜检出的阳性率为11.05%，对PCR检测的190份血液样本进行了不同地区、不同年龄及不同饲养方式的比较分析。结果显示，不同地区及不同饲养方式差异显著，吉林省珲春地区感染率为43.75%，明显高于其他地区(P<0.05)，存在较大差异，可能与地理生态环境和跨境交易运输频率等导致感染率存在差异。放牧牛的感染率为42.86%，显著高于舍饲20.75%(P<0.05)，分析原因可能为放牧牛与蜱的接触几率比舍饲牛高一些。本次调查结果显示，吉林省延边地区为牛卵形巴贝斯病流行地区。

牛的巴贝斯虫在20世纪80年代前我国只有牛巴贝斯虫(B.bovis)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)。白启等从河南牛体内分离到一株大型巴贝斯虫，后经证实为卵形巴贝斯虫(B.ovata)[10-11]。研究表明牛卵形巴贝斯虫与牛瑟氏泰勒虫形态较相似，均由长角血蜱传播[6, 12]。目前国内有关牛卵形巴贝斯虫分子分类学研究尚未见报道，本试验通过系统发育树的分析发现，所检测到的吉林省延边地区牛卵形巴贝斯虫与日本分离株处在同一分支，亲缘关系较近，与河南分离株、韩国分离株亲缘关系较远。牛双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫各自单成一支，说明牛卵形巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫在分子生物学特性上存在明显区别。本试验中通过对吉林省延边地区牛卵形巴贝斯虫遗传进化分析，进一步丰富了牛卵形巴贝斯虫分子流行病学资料。

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MolecularepidemiologicalserveyofBabesiaovatainfectionsincattleinYanbianPrefecture

TIAN Wan-nian1,2, XUE Shu-jiang3, JIA Li-jun3, ZHANG Shou-fa3， LI Guo-jiang1,2

(1.College of Animal Science, Jilin Agricultural Scienceand Technology College, Jilin 132101, China；2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province, Jilin 132101, China；3.College of Agriculture, Yanbian University, Yanji 133002, China)

In order to study the prevalence ofBabesiaovatainfection in cattle in Yanbian area, a molecular epidemiological survey was conducted to examineBabesiaovatausing PCR. 190 blood samples were analyzed. Results showed that the positive rate of Babesia ovata infection by PCR method was 30.52%, which was significantly higher than 11.05% the positive rate by microscopic examination of Giemsa-stained blood smears. The difference between different counties and grazing was both significant(p<0.05). Phylogenetic analysis indicated thatBabesiaovatain the present study was in the same cluster with the Japan strains, but was separated from Henan or Korea strains. The survey confirmed that Yanbian Prefecture was the epidemic region ofBabesiaovata.

Babesiaovata； PCR ； microscopic examination of Giemsa-stained blood smears ； Molecular epidemiology

s：ZHANG Shou-fa ； LI Guo-jiang

S852.72

A

0529-6005(2017)08-0013-03

2016-11-03.

吉林省科技发展计划项目(20150623004TC)；吉林省重点学科培育项目(吉农院合字[2015]第x030号)；吉林农业科技学院种子基金项目(吉农院合字[2014]第Z07号)

田万年(1980-)，男，讲师，博士，主要从事动物寄生虫病研究，E-mail:wannian2000@hotmail.com

张守发，E-mail:shoufazhang@sina.com；李国江，E-mail:illiguojiang@126.com