江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感实验室诊断与分析

孙爱猛，王平兴，周信云，刘丽，吴珺，朱端昊

(吉安市疾病预防控制中心，江西 吉安 343000)

·调查报告·

江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感实验室诊断与分析

孙爱猛，王平兴，周信云，刘丽，吴珺，朱端昊

(吉安市疾病预防控制中心，江西 吉安 343000)

目的 通过real-time RT-PCR对江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感病例进行实验室诊断与分析，进一步提高实验室对人感染禽流感的检测能力。方法 采集人感染H7N9禽流感病例咽拭子并提取RNA，分别采用流感甲/乙型通用引物、季节性流感特异性引物（H1N1、H3N2、H1N1pdm）、禽流感特异性引物（H5、H7、N9、H9、H10）进行 real-time RT-PCR 检测。结果 患者A甲型流感、禽流感H7、N9核酸扩增结果均为阳性；患者B（患者A的母亲）甲型流感、禽流感H7核酸扩增结果均为阳性。结论 经江西省疾控中心流感实验室复核，患者A与患者B均感染H7N9禽流感病毒，为江西省首起人感染H7N9禽流感病毒聚集性病例。

禽流感H7N9；聚集性病例；实验室诊断

2013年3月，我国东部地区出现不明原因重症肺炎病例，后经国家流感中心确证为新型人感染H7N9禽流感病例[1]。流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组大小约为 14kb，由 HA、NA、NP、PA、PB1、PB2、M、NS八个片段所组成。研究表明新型H7N9禽流感病毒是由多种禽流感病毒重配所产生的，其HA基因可能来自于野鸭中的禽流感H7N3，NA基因来自于东亚迁徙候鸟中的禽流感H7N9，余下六个片段来自于禽流感 H9N2[1，2]。 人感染H7N9禽流感引起的临床症状主要有高热、咳嗽、肌肉酸痛、呼吸窘迫进而导致重症肺炎[1，3]；聚集性病例的出现提示新型禽流感病毒在人际间可能进行有限的传播[4-7]。目前针对其检测方法主要有分子生物学检测、血凝抑制试验与病毒培养等[8]；本研究对江西省2例输入性不明原因肺炎患者咽拭子进行实验室检测，最终确诊两位患者为人感染H7N9禽流感聚集性病例，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患者基本情况患者A，男，23岁；患者B，43岁，两者为母子关系。2016年4月8日前均居住在福建某地；2016年3月25日患者A在活禽市场有购买禽肉史，禽肉为现宰现卖，且当天患者A、B均有禽肉加工史。患者A于2016年4月1日发病，患者B于2016年4月5日发病，发病后在当地诊所接受治疗，2016年4月8日两例患者由福建返回江西继续接受治疗。

1.1.2 样本 2016年4月15日以不明原因肺炎病例采集两例患者咽拭子样本低温送至吉安市流感监测网络实验室进行检测。两例患者经上级部门确证为人感染H7N9禽流感病例后按照人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第三版）开展聚集性病例的强化监测，采集密接者等人群咽拭子标本低温送至吉安市流感监测网络实验室进行检测。

1.1.3 主要试剂 病毒RNA提取试剂盒、A/B流感通用型核酸检测试剂盒、季节性流感检测试剂盒（H1N1、H3N2、H1N1pdm）、禽流感核酸检测试剂盒（H5、H7、N9、H9、H10） 均购自中山大学达安基因公司，所有试剂均在有效期内。

1.1.4 主要仪器 ABI7300荧光PCR仪、振荡器等

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸提取提取病毒核酸在生物安全II级（BSL-2）实验室的生物安全柜内进行，提取方法按试剂盒说明书进行。

1.2.2 Real-time PCR检测甲/乙型流感、季节性流感 （H1N1、H3N2、H1N1pdm）、 禽流感（H5、H7、N9、H9、H10）核酸检测及判定标准均按试剂盒说明书进行操作。扩增条件均为：50℃ 15min，1 cycle；95℃，15min，1 cycle；94℃，15s～58℃，45s，45 cycle。

1.2.3 质量控制阴性质控品无明显扩增曲线；阳性质控品有明显扩增曲线，且Ct值≤30；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效。阴阳性质控品由试剂盒自带。

2 结果

2.1 患者咽拭子检测结果使用通用型甲/乙流感、季节性流感 （H1N1、H3N2、H1N1pdm）、 禽流感（H5、H7、N9、H9、H10） 核酸检测试剂盒对提取的病毒核酸进行real-time PCR检测，结果为患者A甲型流感、禽流感H7、N9核酸扩增结果均阳性；患者B甲型流感、禽流感H7核酸扩增结果均阳性，其余均为阴性，扩增结果及Ct值见表1和图1～3。

2.2 密接者及强化监测结果对采集密接者及强化监测的55份咽拭子样本进行real-time PCR进行检测，共检测到乙型流感14份，甲型流感通用性核酸检测均为阴性。

表1 H7N9 real-tim e PCR检测结果

图1 甲型流感核酸通用性检测

图2 新型H7N9 H7亚型检测

图3 新型H7N9 N9亚型检测

3 讨论

病毒侵入宿主细胞需要借助宿主细胞受体才能完成，流感病毒HA受体结合位点的氨基酸序列决定了病毒对禽与人的结合倾向。禽流感病毒在禽类中的宿主受体为SAα-2，3 Gal受体，人上呼吸道黏膜上皮细胞以SAα-2，6 Gal受体为主，下呼吸道以 SAα-2，3Gal受体为主[9]，以往有研究表明禽流感H7能够感染人引起轻微的呼吸道症状[10]，N9感染人尚属首次；从禽类和人分离到的H7N9病毒在 HA区域存在G186V、Q226L、A138S氨基酸替换，这可能导致禽流感对人宿主受体结合力的增加，从而导致跨种属传播的发生[11]。Ding H等人研究证明新型H7N9禽流感病毒在人际间可能存在有限的人际间传播[4-7]；本研究中患者A、B虽然均有禽肉加工史，但并不能完全排除人际间传播的可能性，需要进一步的排除与验证。研究证明H7N9禽流感PB2蛋白发生Q591R和E627K能够明显增强对小鼠的致病性以及病毒在哺乳动物的适应性[12]。郭晓兰在对人感染H7N9禽流感轻重病例病毒全基因组序列分析中发现关键氨基酸位点E627K突变存在差异[11]；与以往人感染H7N9发生重症肺炎多见于年龄偏大的患者不同，患者A为青年患者且自身无基础性疾病，4月8号收治入院后立即使用达菲开始治疗，4月15日因病情持续加重转上级医院继续治疗，分析导致该患者病情加重的原因可能为病毒毒力基因发生改变，从而导致为致病力增强[13]。下一步需要对病毒相关序列进行测序，并对其耐药性基因及毒力基因进行分析。

研究表明人感染H7N9禽流感检测过程中下呼吸道样本的阳性检出率要高于上呼吸道[14]；本研究中两例样本real-time PCR检测的Ct值均接近判断阈值，其主要原因可能是样本来自于上呼吸道，且患者发病时间较长，此时上呼吸道样本中病毒拷贝数偏低；这提示在后期日常传染病监测过程中需要进一步加强采样相关知识及技能的培训，保证检测样本的质量。Sun Y研究表明提取H7N9禽流感病毒核酸时，HA与NA核酸拷贝数有差异，导致real-time PCR检测过程中HA的检出率要高于NA的检出率；本研究中患者B咽拭子样本中检出H7亚型，N9亚型未检出，这与Sun Y研究相符[15]；结合实际工作，后期不明原因肺炎监测中可考虑先对敏感性较高的HA基因进行检测，提高H7N9的检出率。本研究表明随着人员贸易的往来，新发传染病不再局限于某一区域，随时都存在输入性的风险，需要提高警惕并加强监测，做到及时、准确的发现并控制传染病。

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R373.1+3，Q523

A

1674-1129(2017)05-0786-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.054

2017-08-01；

2017-09-13)