一种多孔微晶玻璃在硝化细菌固定化中的应用

张默然， 洪 晔, 王永亚 ， 钟 意, 李 彬

(1.湖州师范学院 工学院, 浙江 湖州 313000; 2. 湖州师范学院 生命科学学院, 浙江 湖州 313000)

一种多孔微晶玻璃在硝化细菌固定化中的应用

张默然1， 洪 晔1, 王永亚1， 钟 意1, 李 彬2

采用溶胶凝胶-添加造孔剂法制备P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2系多孔微晶玻璃，并将其应用于硝化细菌的固定化.结果表明，利用该方法成功制备的多孔微晶玻璃样品具备较高的气孔率和较低的细胞毒性.在硝化细菌固定化实验中硝化细菌的固定量可达40 mg/g，这表明样品具备良好的细菌固定化性能.因此，P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2多孔微晶玻璃在水处理中有着广泛的应用前景.

多孔微晶玻璃； 硝化细菌； 固定化； 细胞毒性

0 引 言

随着我国高密度养殖的不断发展，氨氮处理问题成为困扰该产业继续发展的瓶颈之一[1].传统的水处理技术处理氨氮存在费用高、能耗大等缺点，而生物处理效果远好于传统技术，因此被广泛应用于水质改善[2-3].但目前采用的液状菌剂处理极易流失造成其成本升高[4].近年来兴起的微生物固定化技术可以弥补传统生物脱氮技术中的不足，促使固定化硝化细菌除氨氮成为国内外研究的热点之一[5-7].固化法的优势在于菌落不易流失、稳定性好、能反复多次利用等，而选择合适的固定化载体是技术关键所在[8-10].多孔无机材料由于其可控的多孔结构、比表面积大、生物相容性好等特点已使其成为微生物固定化良好的载体之一.目前的研究主要集中在改性矿物及多孔陶瓷对微生物的固化作用[11-12]，而且主要停留在实验研究阶段，因此需要进一步开发新型载体材料，促进其早日投入到生产应用中.

本文在溶胶凝胶法制备微晶玻璃的基础上，通过添加造孔剂烧结法制备多孔微晶玻璃，以硝化细菌为对象，通过吸附作用固化硝化细菌建立多孔微晶玻璃固化硝化细菌体系，探讨多孔微晶玻璃组成及气孔率对固定化效果的影响.这不仅对于水生养殖具有重要的应用价值，而且也将为水处理提供一定的理论和应用基础.

1 材料与方法

1.1试剂与仪器

碳酸钙(AR,国药集团化学试剂有限公司)、磷酸三乙酯(AR,上海展云化工有限公司)、盐酸(AR,中国杭州化学试剂有限公司)、正硅酸乙酯(AR, 上海凌峰化学试剂有限公司)、硝酸钙(AR, 上海展云化工有限公司)、硝酸铁(AR, 上海展云化工有限公司).

DF-101SJ集热式恒温加热磁力搅拌器(河南省予华仪器有限公司)、SX2-5-12箱式电阻炉(中国上海实验电炉厂)、101-1-BS电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)、S-3400N扫描电镜(日立)、XD-6型X射线衍射仪(普析)、MultiskanFC酶标仪(Thermo)、压片机(国华电器有限公司).

1.2多孔微晶玻璃的制备及硝化细菌的固定

采用溶胶凝胶法制备微晶玻璃前驱体粉末[13]，然后采用玻璃粉末添加造孔剂烧结法制备多孔微晶玻璃.

首先根据玻璃的三元相图计算出前驱体玻璃粉末的化学组成为49CaO·38SiO2·13Fe2O3·4P2O5(moL).称取一定量的正硅酸乙酯溶于无水乙醇中，使正硅酸乙酯和无水乙醇的体积比为1∶3，搅拌均匀后加入蒸馏水，令正硅酸乙酯、磷酸三乙酯这两种物质的总量和蒸馏水的摩尔比为1∶15，搅拌均匀后用盐酸调节pH值为2，再加入一定量的硝酸铁和硝酸钙，于室温搅拌2 h后再静置0.5 h，放入45 ℃水浴锅保温，反应120 min得到溶胶.继续将温度升到65 ℃使水分蒸发，得到的胶体以倾斜失去流动性时为终止.将样品于室温下陈化7天，之后放入120 ℃的鼓风干燥箱中干燥12 h获得干凝胶.放入马弗炉中升温至650 ℃保温1 h(升温速率为5 ℃/min)，随炉冷却，制得前驱体玻璃粉末.

随后把制得的前驱体玻璃粉末和不同粒径的造孔剂碳酸钙混合, 再以聚乙烯醇作为粘结剂，用压片机压制成型，制备条件列于表1中. 将样品放入马弗炉中升温至1 050 ℃保温1 h(升温速率为5 ℃/min)，除去造孔剂，得到多孔微晶玻璃样品.

表1 多孔微晶玻璃的制备条件

将微晶玻璃样品和配制好的硝化细菌悬液在37 ℃隔水式培养箱内进行吸附固定化试验.三天后依次测定三组多孔微晶玻璃对硝化细菌的吸附量.将吸附后的多孔微晶玻璃样品放在60 ℃鼓风干燥箱中干燥至恒重M1，再置于马弗炉中600 ℃焚烧30 min，称重M2，则多孔微晶玻璃对硝化细菌的吸附量Q为：

其中：M0为样品的质量；M1为60 ℃干燥后质量；M2为600 ℃灼烧后质量.

最后将已固定硝化细菌的P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2多孔微晶玻璃样品用PBS缓冲液清洗, 用0.1 M二甲胂酸钠缓冲戊醛固定液固定12 h后，采用二甲胂酸钠缓冲液洗涤，采用70%、80%、90%和100%乙醇梯度脱水(每次脱水时间为10 min)，最后进行冷冻干燥处理.采用扫描电镜观察样品固定化后的微观形貌.

1.3样品的表征

样品的XRD分析在X射线衍射仪上进行，管电压为36 kV，管电流为20 mA，扫描速度8°/min，测试范围5°<2θ<80°.测试前将试样研磨成粉末状，过300目样品筛.采用S-3400N扫描电子显微镜对样品的表面形貌进行观察，测试前对样品进行镀金处理.

采用真空法测定样品的吸水率和显气孔率.首先，清洗样品表面，置于电热干燥箱中于(110±5) ℃下烘干至恒重，置于干燥器中冷却至室温.称取试样干重质量m1.然后将样品条放在烧杯中，在真空条件下保压干燥5 min.将蒸馏水缓慢注入烧杯中，直至完全浸没样品条，浸泡5 min后，从真密度仪中将样品和烧杯一起取出，在空气中静置30 min.然后将饱和的样品放入金属丝网篮中，并把金属丝网篮悬挂在带有溢流装置的容器中.此时饱和样品质量为m2.从液体中取出饱和样品条，用微湿的多层纱布，擦去样品条表面附着的水分，迅速称量饱和样品在空气中的质量为m3.用下列公式计算样品的吸水率和显气孔率：

细胞毒性分析采用CCK-8试剂盒检测.将对数生长期的人正常结直肠粘膜细胞(FHC)按照5×104个/毫升的浓度接种于96孔板中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度下培养.培养基中额外加入10%的胎牛血清(FBS，Gibco)、青霉素(l00 U/mL)和链霉素(100 μg/mL).培养48 h后，吸掉上层清液，将细胞培养基换成含有不同浓度的多孔微晶玻璃样品的培养基(0，12.5，25，50，100，200 μg/mL)继续培养24 h.然后吸掉上清液，用PBS清洗细胞两次，每孔换上新鲜的完全培养基100 μL，并加入10 μL CCK-8溶液继续培养2 h.最后采用酶标仪检测在450 nm的吸光度来确定细胞的存活率.

2 结果与讨论

样品的显气孔率及吸水率列于表2中，结果表明在其他制备条件相同的情况下，造孔剂的粒径对样品的气孔率会产生一定的影响.样品A2、A3、A4所添加的造孔剂粒径依次为20、50、100目.对比发现，添加造孔剂粒径为50目的A3样品的显气孔率最大，添加造孔剂粒径为100目的A4的显气孔率最小.因而样品的气孔率受到造孔剂大小的影响，但整体看，三组显气孔率相差不大，并无明显规律性.

表2 样品的显气孔率以及吸水率

样品的XRD结果如图1所示，通过与标准卡片比对得出，样品的主晶相为赤铁矿、硅灰石和少量的羟基磷灰石.造孔剂的晶粒尺寸对样品的晶相组成几乎没有影响.在其晶相中出现的羟基磷灰石为骨组织的主要成分，该晶相的出现意味着该样品具备良好的生物活性[14].

不同样品浓度的微晶玻璃对应的细胞毒性如图2所示.结果表明，细胞活性率并没有随样品浓度的增大显著降低.当样品质量浓度小于或等于100 μg/mL时，细胞活性率超过100 %；当样品含量为400 μg/mL时，细胞活性率仍可保持在90%以上，这表明样品具有良好的稳定性.根据国家标准，该材料对细胞毒性较弱，属于一级材料.这也意味着微晶玻璃对细胞本身的增殖没有太大的毒副作用，几乎不影响细胞的存活率[15]，因此该体系微晶玻璃可以应用于细菌的固定化应用中.

为了验证多孔微晶玻璃样品固定化前后表面形貌的改变效果，对固定化前后样品A3的表面形貌进行电镜扫描观测，结果如图3所示.图3(a)为样品固定硝化细菌前的形貌，样品表面平整规则，孔洞分布均匀；图3(b)、3(c)为样品固定硝化细菌后的形貌，在样品表面及孔洞周围富集了大量的硝化细菌菌落；图3(d)是呈杆状的硝化细菌形态的放大照片，可见大量的硝化细菌密集聚集在样品周围.上述结果表明，本文成功实现了多孔微晶玻璃对硝化细菌的固定.

多孔微晶玻璃样品对硝化细菌的固定量见表3，结果表明，多孔微晶玻璃样品对硝化细菌具备较好的固定化效果，三组样品的硝化细菌固定化率均超过1%.尤其样品A3，其细菌固定量最大，达到40 mg/g.这在一定程度上表明，造孔剂粒径导致的显气孔率的差异会对硝化细菌的固定量产生一定的影响，而多孔微晶玻璃样品孔径分布及表面电位对固定化效果的影响则需要进一步的实验研究.

表3 多孔微晶玻璃样品对硝化细菌的固定量

3 结 论

采用溶胶凝胶-添加造孔剂法可制备出具有良好生物活性的P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2多孔微晶玻璃.造孔剂的粒径会对样品的显气孔率产生一定的影响，从而改变多孔微晶玻璃对硝化细菌固定化效率.结果表明，添加的造孔剂粒径为50目时，样品的显气孔率最大，且硝化细菌的固定化能力最强，强度可达40 mg/g.结果表明，P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2多孔微晶玻璃对硝化细菌具有较好的固定能力，因此多孔微晶玻璃固化硝化细菌技术应用于污水氨氮处理有着有广泛的应用前景.

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OntheApplicationofaKindofPorousGlassCeramicsinImmobilizationofNitrifyingBacteria

ZHANG Moran1, HONG Ye1, WANG Yongya1, ZHONG Yi1, LI Bin2

(1.School of Engineering, Huzhou University, Huzhou 313000, China;2.School of Life Sciences, Huzhou University, Huzhou 313000, China)

P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2porous glass ceramics was prepared by sol-gel-addition pore-forming agent method and applied to the immobilization of nitrifying bacteria. The results showed that the porous glass has high porosity and low cytotoxicity. The amount of nitrifying bacteria in the nitrifying bacteria immobilization experiment reached 40 mg/g, indicating that the sample had good bacterial immobilization properties. Therefore, P2O5-Fe2O3-CaO-SiO2Porous glass-ceramic has a wide application prospect in water treatment.

porous glass ceramics; nitrifying bacteria; immobilization; cytotoxicity

2017-06-10

浙江省自然科学基金青年基金项目(LQ16E020001)；国家自然科学基金面上项目(51372081).

王永亚，讲师，研究方向：材料化学.E-mail：arince@zjhu.edu.cn

(1.湖州师范学院 工学院, 浙江 湖州 313000; 2. 湖州师范学院 生命科学学院, 浙江 湖州 313000)

TB321

A

1009-1734(2017)08-0027-06

[责任编辑邵圣文]