纳米氧化铁对豇豆生长及其抗氧化系统的影响

赵 铭，甘秋良，李俊丽，刘泽文，孙慧伦

(武汉理工大学生物技术系，湖北 武汉 430070)

纳米氧化铁对豇豆生长及其抗氧化系统的影响

赵 铭，甘秋良，李俊丽*，刘泽文，孙慧伦

(武汉理工大学生物技术系，湖北 武汉 430070)

研究纳米氧化铁对豇豆幼苗的生理生长的影响。以豇豆为对象，从植物生理生长、根系活力、脂质过氧化作用以及抗氧化酶系的活力水平4个方面研究了不同浓度的纳米氧化铁对豇豆幼苗产生的影响，并以Fe2+处理组作为对照研究纳米氧化铁对植物生长潜在的促进效应以及剂量依赖性,同时通过荧光显微镜观察荧光纳米氧化铁处理的豇豆幼苗以研究纳米粒子的转运。结果表明，不同浓度的纳米氧化铁对豇豆的生长发育有着不同的影响，低浓度的纳米氧化铁对豇豆幼苗的生长有一定的促进作用，高浓度的纳米氧化铁和Fe2+对豇豆幼苗的生长有抑制作用，呈现出一定的植物毒性。豇豆根部对纳米氧化铁进行了吸收并运输到豇豆的茎部，并有一定含量的积累。纳米氧化铁可尝试应用于豇豆的农业生产活动，但在此之前须进一步开展其存在的环境、生态与人体健康风险研究。

纳米氧化铁；豇豆；植物生理

纳米级结构材料简称为纳米材料，具有与一般材料所不同的独特理化性能，表现出许多优异的性能和全新的功能，已在许多领域展示出广阔的应用前景[1]。近些年来随着纳米科技的迅速发展，纳米材料的影响已经渗透到人类生活的各个领域，给人类的生活带来了不容忽视的影响[2]。正是由于纳米粒子的特性，使得其能够很容易进入生物体，并且和生物体中的组织、细胞、生物大分子相互作用，对生物产生一定的影响。纳米级污染物在环境中存在的浓度一般较低，但它们一旦被摄入后即可长期结合潜伏，不断积累增大浓度，终致产生显著毒性效应[3]。植物是自然界的生产者，也是生物富集的起点。通过食物链逐级高位富集，可导致高级生物的毒性效应。研究纳米粒子对植物的影响可以帮助更好的使用纳米粒子。纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)对植物生理影响的研究涉及纳米颗粒对根伸长的影响居多，大部分研究发现金属和金属氧化物纳米颗粒对根伸长有抑制作用。有研究发现不同表面修饰的纳米氧化铝对根伸长有不同的影响[4]。有研究结果表明高浓度的Zn和ZnO纳米颗粒悬浮液分别对黑麦草和玉米发芽率有抑制作用，不同纳米颗粒对不同植物根伸长抑制作用不同，2000 mg/L的Zn和ZnO纳米颗粒完全抑制根的伸长[5]。也有实验表明在浓度为2000 mg/L时,纳米CeO2对植物根伸长没有影响，而纳米La2O3、Cd2O3、Yb2O3对7种植物的根伸长均有显著抑制作用[6]。Stampoulis等研究了ZnO、Ag和Cu纳米颗粒对西葫芦发芽率的毒性作用，发现这些纳米颗粒释放的离子抑制了植株生长[7]。根据上述研究可见不同的纳米粒子对于不同的植物有着不同程度的影响，而这种影响程度的大小与纳米粒子本身的性质和其分散在水溶液中后形成的溶液的浓度有着较高的相关性。本实验以豇豆和纳米氧化铁为主要研究对象，并从植物生理生长、根系活力、脂质过氧化作用以及抗氧化酶系的活力水平四个方面研究了不同浓度的纳米氧化铁对豇豆幼苗的生理生长所产生的影响。

1 材料与方法

1.1 植物幼苗的准备与处理

取150粒去皮的豇豆种子(种子取自湖北省农科院)于无菌水中浸泡1.5 h，加入70 %乙醇浸泡30 s，再用无菌水洗涤3次，于5 %次氯酸钠溶液中浸泡10 min，用无菌水洗涤3次后置于珍珠岩中避光室温下发芽，选取长势一致的移入霍格兰式液中。纳米材料为纳米磁性氧化铁(γ-Fe2O3，于麦克林购买)、20 nm、球形、99.5 %。将纳米粒子用超声振荡的方式分散到去离子水中形成均一稳定的水溶液。将纳米氧化铁母液分别加入到水培盒中使其终浓度为20、50、100 mg/L，另一个空白对照，一个加入50 μmol/L硫酸亚铁做对照；标记后放入人工气候箱中培养，湿度60 %。生长至两叶一心后进行各项生理指标测定。

1.2 各项生理指标的测定方法

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定：采用氮蓝四唑光还原法测定[8]。过氧化物酶(POD)活性的测定：采用愈创木酚法测定[8]。过氧化氢酶(CAT)活性的测定：参照张亚宏等的方法[9]。丙二醛(MDA)含量测定用硫代巴比妥酸(TBA)反应法[10]。采用2，2’-联吡啶比色法[11]测定豇豆根细胞原生质膜上Fe3+的还原酶活性。叶绿素含量的测定：取新鲜叶片，用蒸馏水洗净、揩干，研磨成浆，采用乙醇提取、分光光度法测定。可溶性蛋白含量的测定：采用考马斯亮蓝G-250染色法[12]。可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法[13]。

以上所有试验设置3个平行。采用独立样本t-检验法检验实验组和对照组的差异性，可信度为95 %。

1.3 荧光切片观察

被荧光分子修饰了的氧化铁纳米粒子在紫外光下显青色，而豇豆本身显蓝色，通过豇豆的荧光检测可以研究纳米氧化铁粒子是否在豇豆中运输的或者是是否在豇豆体内发生了离子转化。根据实验室已建立的荧光纳米粒子制备技术，制备符合要求的荧光纳米氧化铁粒子，并添加到豇豆幼苗的培养液中，于避光条件下培养一段时间。选取荧光纳米氧化铁条件下培养过的豇豆植株进行切片，分别取根尖、成熟区以及茎部进行横切或纵切进行荧光观察。

2 结果与分析

2.1 纳米氧化铁对抗氧化酶活力的影响

抗氧化酶系包括SOD，POD，CAT等多种酶的植物抗氧化应激系统，当植物受到外界胁迫，体内产生大量活性氧自由基离子时候，这些抗氧化保护酶就会清除产生的自由基，以减轻对植物的毒性作用，抗氧化酶的活性直接反映了植物组织或细胞受到胁迫的一个程度[14]。施加了纳米氧化铁的豇豆幼苗与对照组的SOD活性没有明显的差异，但50 mg/L的纳米氧化铁处理组相对于20 mg/L处理组的SOD活性要高，说明纳米氧化铁产生的氧化胁迫随着其浓度的升高而增大，但当纳米粒子的浓度过高，产生的超氧阴离子浓度过高，超过了SOD的清除能力，此时植株采取其他方式去应对这种高氧化胁迫，因此100 mg/L纳米氧化铁处理下的SOD的活力有所下降，但仍在发挥作用(图1a)。施加了20和50 mg/L纳米氧化铁的处理组的POD的活力相对于对照组分别低42.35 %和31.01 %。100 mg/L纳米氧化铁处理组POD活性与对照组无明显差异(图1b)。可能在这种高浓度的纳米氧化铁的影响下，由SOD清除超氧阴离子产生的过氧化氢更多的是由CAT来分解，这与图1c中所展示的相一致。Fe2+处理下POD活性比对照高(图1b)，此时在没有纳米氧化铁的情况下，则是由POD来分解过氧化氢。20和50 mg/L纳米氧化铁处理下CAT活性与对照组没有明显差异，100 mg/L时CAT活性明显高于对照组。CAT活性的升高说明豇豆植株增强抗氧化系统除去多余的活性氧。Fe2+处理下CAT活性比对照低(图1c)。在这3种酶组成的抗氧化体系中，SOD和CAT存在着协同效应[15]，可以推测POD和CAT同时在对SOD清除产氧阴离子产生的过氧化氢进行分解。

图1 不同处理条件下豇豆3种抗氧化酶的活性Fig.1 Activity of three kinds of antioxidant enzymes

2.2 纳米氧化铁对MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化的主要产物之一，其含量可以表示膜脂过氧化的程度。过量的活性氧会引发或是加剧膜脂过氧化，造成细胞膜系统损伤，干扰植物正常的代谢过程。SOD酶，POD酶还有CAT酶在过量活性氧的堆积下，酶活和脂质膜结构被破坏，就会导致丙二醛的含量升高[16]。随着纳米氧化铁的浓度的增大，MDA的含量明显上升，与抗氧化酶系活力所呈现的结果一致，随着纳米氧化铁浓度的增高，纳米氧化铁对豇豆产生的氧化胁迫也随之相应的增大，在100 mg/L时对豇豆造成的氧化损伤最大。50 μmol/L的Fe2+产生的氧化损伤与50 mg/L纳米氧化铁产生的氧化损伤没有明显差异(图2)。低浓度的纳米氧化铁所产生的胁迫在豇豆能抵抗的范围之内，所以产生的氧化损伤也相对较小，但当浓度过高，超过了豇豆本身的抵抗能力，就会伤害到植株。在不含铁元素的对照组中，缺铁的逆境也会导致豇豆幼苗产生脂质过氧化作用，而Fe2+处理组也有较高的MDA含量，这与预期不相符，其原因可能是相对于处理前的生长环境，大量的营养元素在短时间内形成了一个逆境，使得MDA含量较高。

图2 不同处理条件下豇豆MDA含量Fig.2 MDA contents of cowpea under different treatments

2.3 纳米氧化铁对Fe3+还原酶活性的影响

铁在一系列的生理活性中扮演者重要的角色，如O2的运输，DNA的合成，以及电位传导；因此铁的摄取在生命体的生命活动中是一个相当重要的环节。在正常的生理pH值和氧含量下，铁元素一般是以可溶性的Fe(Ⅲ)的形式存在的，因此即使生命体摄取了Fe(Ⅱ)，其在正常的生理状态下也是不稳定的[17]。20和100 mg/L的纳米氧化铁处理组的Fe3+还原酶活性明显高于50 mg/L的纳米粒子处理组(图3)，可能在数据测量的过程中出现了操作失误导致50 mg/L处理组数据不准确，但总体来看，纳米氧化铁会使得豇豆根系Fe3+还原酶升高，说明了纳米氧化铁在缺铁胁迫下可以起到一定的补铁作用。对照组由于处于缺铁的逆境下，豇豆幼苗为了获取足够的铁来维持正常的生长，所以Fe3+还原酶活力比较高。在Fe2+处理组，由于能满足豇豆生长对铁元素的需求，并且是植株能够直接吸收的Fe2+，所以Fe3+还原酶相对的较低。

图3 不同处理条件下豇豆根系Fe3+还原酶活Fig.3 Fe3+ reductase contents of cowpea root under different treatments

2.4 纳米氧化铁对叶绿素含量的影响

叶绿素是植物吸收光能进行光合的色素,在一定范围内,光合强度随其含量增加而加强。因此它是反映植物丰产性能的生理指标之一。植物叶片叶绿素含量是表征植株体内铁营养状况的重要指标。随着纳米氧化铁浓度的增大，叶绿素的含量有很明显的升高，相比于50 μmol/L Fe2+的对照组也有明显的升高(图4)，说明纳米氧化铁对于豇豆的生长有一定的促进效应，结合之前的Fe3+还原酶活性分析，在100 mg/L纳米氧化铁处理下的豇豆的Fe3+还原酶活性比较的高，也说明纳米氧化铁促进了植物对铁元素的吸收。另外纳米氧化铁处理的豇豆叶绿素含量高于Fe2+对照组(P<0.01)，说明同样浓度下，纳米氧化铁可能较Fe2+对照组更有利于豇豆的生长，所具有的植物毒性也较小。

2.5 纳米氧化铁对可溶性糖含量的影响

可溶性糖是衡量植物碳素代谢的一个重要指标，当植物处于逆境时，体内的可溶性平衡就会发生变化，以适应外界环境条件的变化[18]。50 mg/L纳米氧化铁处理的豇豆叶子中可溶性糖含量最高，在纳米氧化铁浓度较低时，随着浓度的增加，可溶性糖含量增加，但纳米氧化铁浓度过高后对可溶性糖含量反而下降(图5)，可能原因是过高的纳米氧化铁浓度对植物造成的膜损伤较严重，这一点与之前的MDA含量分析相符，即导致了叶绿体的损伤，所以在100 mg/L的纳米氧化铁处理下有着较高的叶绿素含量，但是可溶性糖的合成依旧不足，所以导致了含量的下降。

图4 不同处理条件下的豇豆叶绿素含量Fig.4 Chlorophyll contents of cowpea under different treatments

图5 不同处理条件下的可溶性糖含量Fig.5 Soluble sugar contents of cowpea under different treatments

2.6 纳米氧化铁对可溶性蛋白含量的影响

蛋白质作为细胞结构的重要组成部分，是生命的体现者，蛋白质参与细胞的任何新陈代谢活动。蛋白质含量在生物体内维持着一定程度的代谢平衡，而当植物发育、衰老或是受到外界胁迫时，这一平衡会有所波动[19]。在低浓度下，随着纳米氧化铁浓度的增加，可溶性蛋白质含量减少(图6)，可能是由于当纳米氧化铁浓度升高时，纳米粒子在根表面吸附的量增大，阻碍了营养元素如N、S的吸收，使得蛋白质的合成量降低，但细胞新陈代谢在合成蛋白的同时，也会消耗部分的蛋白质，合成量减少就导致50 mg/L纳米氧化铁处理的豇豆体内积累的蛋白质总量比低浓度纳米氧化铁处理的豇豆体内可溶性蛋白总量要少。但在100 mg/L处理组中，可溶性蛋白含量反而较高(图6)，这可能是由于过高的纳米粒子浓度导致的膜损伤释放出了较多的蛋白，同时植物为了应对这种高氧化胁迫，其体内的多种酶的含量也有所上升。因此100 mg/L纳米氧化铁处理下的可溶性蛋白含量急剧上升。

2.7 豇豆对纳米氧化铁的吸收蓄积

被荧光分子修饰了的氧化铁纳米粒子在紫外光激发下显青色，而豇豆自身则显蓝色，荧光纳米氧化铁主要存在于细胞间隙(图7a、图7b)，说明荧光纳米氧化铁能够进入根里面，同时从上皮层运输到皮质层主要是通过质外体途径。部分荧光纳米氧化铁经过根运输到了豇豆的茎，沿质外体途径运输到茎以后主要通过茎的维管束继续往上运输(图7c)，荧光纳米氧化铁在茎中连续运输，且含量较高(图7c’)，当纳米氧化铁运输到茎的上部分，主要分布在细胞间隙(图7d)，说明荧光纳米氧化铁主要通过质外体途径继续往上运输。根部荧光显微观察说明荧光纳米氧化铁通过豇豆的根尖部分进入植株体内，通过质外体途径不断向上运输，运输到茎时已有大量荧光纳米氧化铁的积累。

图6 不同处理条件下的可溶性蛋白含量Fig.6 Soluble protein contents of cowpea under different treatments

图7 根部荧光显微观察Fig.7 Fluorescence microscopic observation of the root

3 讨 论

通过对豇豆幼苗Fe3+还原酶活、叶绿素含量、可溶性蛋白质和糖含量及SOD、POD、CAT酶活性等生理指标的测定，结果显示相同低浓度下，纳米氧化铁较Fe2+更有利于豇豆幼苗的生长，而随着纳米氧化铁浓度的增加，产生了剂量相关的不同程度的氧化损伤，高浓度时可抑制植物的生长，呈现一定的植物毒性。荧光显微实验也表明纳米氧化铁处理后的豇豆茎以及根尖的细胞结构变化，纳米氧化铁可以通过豇豆的根部进行吸收并连续的运输到豇豆的茎甚至一直往上运输，并且在根部没有纳米氧化铁的积累，而在茎会发生纳米氧化铁的积累。

4 结 论

低浓度的纳米氧化铁可尝试运用于豇豆的农业生产中，尤其在缺铁的环境时可以用作铁肥。但考虑到纳米颗粒对人体健康和环境存在的风险，将来必须进一步开展氧化铁纳米物质存在的人体健康、生态、环境的风险研究。

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(责任编辑 李山云)

EffectofNano-ironOxideonGrowthofCowpeaSeedlingsandRelevantAntioxidantResponse

ZHAO Ming，GAN Qiu-liang，LI Jun-li*，LIU Ze-wen，SUN Hui-lun
(Wuhan University of Technology department of Biotechnology，Hubei Wuhan 430070,China)

In order to study the effects of iron oxide nanoparticles on the physiological growth of cowpea seedlings,taken a cowpea as tested objects,the effects of different contents of iron oxide nanoparticles on the production of cowpea seedlings in plant physiological growth, root activity,lipid peroxidation and the activity of antioxide enzyme were studied,Fe2+treatment was set as a positive control to research the effect of iron oxide nanoparticles on the potential promotion of cowpea seedling growth and its dose dependent,meanwhile cowpea seedlings treated with fluorescent iron oxide nanoparticle were observed by the fluorescent microscope. The result showed that the cowpea seedlings had different responses to iron oxide nanoparticles under various concentrations,the low concentration of iron oxide nanoparticles had some positive effects on cowpea seedlings, and the high concentration of iron oxide nanoparticles and Fe2+partly inhibited the growth of cowpea seedlings and indicated a certain toxicity to plants. The iron oxide nanoparticle absorbed by the roots of cowpea and then transported to the stem of cowpea which subsequently accumulated to certain contents was found.It is possible that iron oxide nanoparticles are used as iron fertilizer in agricultural industry, but the risk of nanoparticles to the environment, ecology and human health must be studied first.

Iron oxide nanoparticles；Cowpea；Plant physiology

1001-4829(2017)3-0547-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.011

S643.4

A

2016-03-10

国家自然科学基金青年基金项目(31301735)；国家大学生创新创业训练计划(20161049720006)

赵 铭(1995-)，男，湖北宜昌人，主要研究方向为生物技术，E-mail:940970188@qq.com，Tel：15629030259，*为通讯作者：李俊丽(1980-)，女，湖北武汉人，博士，纳米生物效应，E-mail:lijunli0424@sina.com，Tel：18971243840。