四种食源性肽改善光老化大鼠皮肤皱纹及屏障功能的实验研究

徐德峰++马忠华++赵谋明++张婷++苏国万++段军毅

[摘要]目的：評价四种食源性肽口服暴露对SD大鼠光老化皮肤皱纹及屏障功能的改善效果。方法：将112只健康成年雌性SD大鼠随机平均分为空白对照组、模型组、肽样品组，每种肽分别设定低、中、高剂量组，配制浓度为0.3、0.9、1.5g/L的含肽水溶液进行口服，每日自由饮用；空白组不施行紫外辐照，模型组及肽样品组均行UVA+UVB联合辐照，连续辐照18周后进行皮肤表观皱纹评分，检测皮肤表皮水分含量和油脂含量，评价4种食源性肽对光老化大鼠皮肤皱纹和屏障功能的改善效应。结果：与正常对照组相比，模型组大鼠皮肤皱纹感官质量显著降低，肽口服干预后可不同程度改善皮肤皱纹状况，且总体呈剂量-效应关系，不同活性肽之间改善效果差异较大，以样品2高剂量组效果最好；从屏障功能来看，模型组大鼠皮肤水分和油脂含量显著低于空白组（P<0.05）；4种活性肽口服干预后光老化皮肤水油屏障功能恢复良好，样品2和核桃肽中、高剂量时可显著提升表皮水分和油脂含量（P<0.05）。结论：样品2能显著减少光老化大鼠皮肤深大皱纹量，改善受损皮肤屏障功能，是口服抗皱活性肽产品开发的首选基料。

[关键词]活性肽；口服；SD大鼠；光老化；屏障功能

[中图分类号]R758.14 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）09-0049-05

Comparative Analysis of Four Kinds of Food-derived Peptides with Oral Supplementation on the Wrinkling and Barrier Function Status in Photoaging

Skin of SD Rat

XU De-feng1，2，MA Zhong-hua1，ZHAO Mou-ming2，ZHANG Ting1，SU Guo-wan2，DUAN Jun-yi3

[1.Technique Center of Infinitus （China） Co. Ltd.，Guangzhou 510665，Guangdong，China； 2.College of Light Industry And Food Science Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China； 3.College of Agriculture and Animal Husbandry，Tibet University， Linzhi 86000， Tibet，China]

Abstract： Objective To evaluate the improvement of four kinds of food-derived peptides with oral supplementation on wrinkling and barrier function status of SD rat photoaging. Methods 112 of healthy adult female SD rats were randomly divided into normal control group， ultraviolet exposed group and peptides administration groups. Except the normal group， all animals in model and peptides administration groups were exposed to radiation of UVA in companying with UVB. The low， middle and high-dose bioactive peptides administration were obtained by preparing the water solution of peptides with concentration of 0.3， 0.9 and 1.5g/L respectively. And then the obtained peptides solution was orally administrated to the SD rats in peptides treating groups as the sole drinking source. The model and peptides groups were exposed to UV irradiation thrice weekly for 18 weeks until the photoaging model was established and then the improvement of four kinds of food-derived peptides on wrinkling and barrier function was evaluated by sensory scoring and operatically detection. Results In comparison with the rats in normal control group， the animals in model groups had remarkable wrinkling formation and this degradation in wrinkling status was improved by oral supplementation of peptides and the effectiveness was in a dose-effect manner and dependent on the kind and concentration of， of which the sample of peptides 2 exhibited most distinguished wrinkling elimination. Furtherly， judging from the water and oil barrier function of skin， the moisture and lipid concentration of skin in model group were significantly lower than those in normal group and the barrier function was desirable improved by oral supplementation of peptides （P<0.05）. At middle and high dose， the sample 2 and peptides significantly enhanced the moisture and lipid concentration of skin （P<0.05）. Conclusion Sample 2 can remarkably eliminate the deep and huge wrinkles and restore the barrier function in photoaging skin of SD rats， and thus to be the element ingredient for developing an anti-wrinkling product with peptides.endprint

Key words： peptides； oral supplementation； SD rats； photoaging； barrier function

皮肤老化与抗衰老是当今皮肤科学的研究热点，紫外线辐射引起的皮肤光老化是皮肤外源性衰老的主要原因[1]。光老化导致皮肤过早出现粗糙、皱纹、色素异常、脆性增加、毛细血管扩张及皮革样外观等症状，严重影响皮肤外观，导致皮肤屏障功能受损[2-4]。随着审美标准的不断提高，人们对皮肤光老化的防治越来越重视，鉴于皮肤组织的天然“砖墙结构”的致密屏障，只有分子量小于3 000Da以下的分子才能透皮吸收，而且功效成分大多化学结构稳定性较差，长时间暴露于紫外线等环境中极易分解，失去本身应有的抗衰功能甚至产生有毒物质[5]。因此，通过饮食等内在途径改善皮肤屏障功能，减少皮肤皱纹量，从而改善光老化皮肤表观形态已是新一代抗衰功能食品开发的必然趋势。本研究对四种食源性肽进行口服实验，根据光老化皮肤皱纹改善及屏障功能恢复情况，筛选最佳食源性肽，为抗衰产品开发奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂：健康雌性SPF级SD大鼠168只购自广州中医药大学实验动物中心提供，周龄10周，体质量180～200g，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2011-0029，质量合格证号：No.44008500003344。

食源性肽样品1、2、3由无限极（中国）有限公司技术中心提供（样品1为狭鳕皮肤胶原蛋白肽，购自广州维晟生物科技有限公司；样品2为牛源弹性蛋白肽，由无限极（中国）有限公司技术中心自制；样品3为鲣鱼动脉球弹性蛋白肽，购自 Hayashikane Sangyo Co，.Ltd），核桃肽由华南理工大学赵谋明教授惠赠。新鲜基础鼠粮及清洁刨花垫料购自广州市花都区实验动物养殖场。

1.2 主要设备：紫外光辐照箱为本实验室自行设计安装[6]，已获专利授权（专利号：ZL201520152906.5）。紫外线灯管：UVA Philips 340-40WT12-G13，波长范围320～400nm，波峰340nm；UVB Philips 313-40WT12-G13，波长范围300～320nm，波峰313nm。UV-A型、UVB297型紫外辐照计购自北京师范大学光电仪器厂。大鼠实验笼购自苏州市苏杭科技器材有限公司。FC1502菲斯·凯尔皮肤分析仪来自深圳凯尔电子厂。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型建立：SD大鼠饲养在专用鼠笼中，环境设施符合试验动物SPF级等级要求，室温20℃～25℃，湿度40%～70%，自然昼夜交替。动物实验遵守实验动物伦理学要求，大鼠适应性喂养1周后，最终选取112只健康SD大鼠随机分为14组，正常对照组、模型组和肽样品组（4种肽样品分为设置低、中、高剂量组），每组8只，各组大鼠分2笼饲养，每笼4只。正常对照组与模型组以清洁自来水为唯一饮用水，肽样品低、中、高剂量组分别在清洁自来水中分别加入终浓度0.3、0.9、1.5g/L的样品1、2、3及核桃肽，饲料均为基础饲料，自由摄食。

正常对照组不进行辐照，其余各组进行等量紫外辐照。参照文献[6-9]，用记号笔画出背部脊柱两侧约5.0cm×5.0cm区域并用电推剪剃除毛发，每次辐照前剃毛并進行Na2S化学脱毛，将脱毛大鼠放入自制固定器中暴露背部剃毛皮肤，连同固定器和大鼠置于紫外线光源（UVA+UVB）正下方40cm处进行紫外辐照，紫外辐照计测得该处UVA强度为177.9mW/cm2，UVB强度为59.6mW/cm2。辐照频率为隔天辐照1次，时间为第1周10min/d，第2周20min/d，第3周30min/d，之后维持在30min/d，第18周皮肤外观呈典型老化状态表示造模结束，累计照射剂量为UVA 150.88J/cm2，UVA 78.67J/cm2，紫外辐照结束后对各组大鼠进行观察拍照。

1.3.2 皮肤表观皱纹测定评分：参照文献资料[10]，根据皮肤横向皱纹的情况对光老化程度和改善效果进行评分，评分依据见表1。

1.3.3 皮肤屏障功能测定：皮肤屏障功能评价采用皮肤表皮水分含量和油脂含量进行量化，FC1502菲斯·凯尔皮肤分析仪进行测定，具体按照仪器说明书进行操作，采用点触式测量，测3次取平均值。

1.4 统计学分析：使用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，实验数据以均数±标准差（x?±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD检验法，方差不齐时采用Dunnetts T3 进行比较，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SD大鼠皮肤光老化动物模型建立结果：光照前大鼠皮肤光滑，色泽正常，有弹性，无明显皱纹。连续辐照，从第4周开始出现少许红斑、脱屑，并可见少量横向较浅皱纹，随造模时间延长，皱纹逐渐加深，红斑炎症反应在第10周左右达到高峰，之后炎症反应有所减轻，而皱纹、干燥、松弛持续加重，18周时可见明显而持久的横向皱纹，皮肤松弛、缺乏弹性、干燥粗糙，伴有脱屑、角化过度，色泽黯淡、部分存在色素异常，严重者呈皮革样外观，表明成功构建了SD大鼠皮肤光老化动物模型。见图1。

2.2 各组SD大鼠皮肤外观观察及评分结果：由图2A可以看出，与正常对照组相比，模型组SD大鼠皮肤表皮粗糙、皱纹明显，呈典型皮革样外观，表明造模成功。与模型组相比，4种食源性肽对皮肤光老化均呈现出一定的修复效果，整体呈现一定的量效关系，但不同样品的效果存在明显差异：①低剂量时各肽样品效果均不明显；②中剂量时各样品修复效果差异明显，样3组外观无明显改变，样1有轻微改善；③高剂量时样1和样3皮肤横向粗大皱纹虽有轻微改善，但不如样2和核桃肽改善明显。

由图2B可知，模型组感官分值低于2.0，显著低于空白对照组（P<0.05），而肽干预后光老化皮肤皱纹分值基本呈量-效关系提高，但不同样品其提升效果差异较大，尤其在中、高剂量时其差异可达到显著性水平。在中剂量时，样2感官分值可达到4.1，显著高于其他三种活性肽（P<0.05），在高剂量时样2分值基本不再增加，而核桃肽此时达到3.8，接近样2效果。综合表观形态及皱纹等级量化评分结果可知，样品2和核桃肽在改善光老化皮肤皱纹方面效果最为显著。endprint

2.3 各组SD大鼠皮肤屏障功能测定结果：由图3A可以看出，与正常对照组相比，模型组SD大鼠皮肤在光老化造模过程中表层水分含量显著降低（P<0.05），表明皮肤水屏障功能严重受损，与模型组相比，不同食源性活性肽口服干预后水屏障功能有不同程度恢复，且水分含量总体呈量-效关系上升，但不同肽其改善效果差异明显。样品2在低剂量时就可明显提高皮肤角质层含水量，在中、高剂量时达到显著性水平（P<0.05），核桃肽效果次之，但样1和样3虽然也呈量-效关系改善皮肤水分含量，但效果显著低于样2和核桃肽。与水分含量提升类似，活性肽口服干预后对光老化皮肤表层油脂含量也呈一定的量-效性提高。在低剂量时基本对油脂含量没有影响，中、高剂量时样2和核桃肽可显著提升油脂含量（P<0.05），且样2显著优于其他样品（图3B）。

3 讨论

目前皮肤光老化机制尚不明确，建立光老化动物模型对研究光老化机制和治疗光老化疾病有着重要意义。鉴于SD大鼠具有价格低廉、适用性广、取材面积大等优点[8-9]，本研究以SD大鼠进行光老化造模，结果表明经连续18周低剂量UVA+UVB联合辐照成功复制了光老化动物模型，与文献报道的动物模型表观形态基本相同[8，11]，为功效评价和机制解析奠定了基础。

相关研究表明[12-14]，口服VC、VE、多酚类等具有抗氧化活性的物质可增强抗皮肤组织氧化酶活性，调整免疫水平，减轻或修复光老化皮肤氧化损伤。自Mellander 1950年首次揭示食源性生物活性肽具有生物活性以来，食源性生物肽的生物功能就一直引起科学家的兴趣和关注，生物肽的多种生物功能已被报道，其中改善人和动物皮肤老化功能也逐渐被报道[4，15-17]。Proksch[15]对114名年龄45～65岁女性随机接受2.5g胶原蛋白肽或相应安慰剂连续8周口服暴露，通过双盲实验研究评价了胶原蛋白特定生物肽VERISOL（R）在控制眼睑部位皮肤皱纹形成，刺激前胶原蛋白I、弹性蛋白、原纤蛋白生物合成方面的作用，证实口服特定生物肽BCP可减少皮肤皱纹，并对真皮基质合成有良好促进效果。基于食源性肽在改善皮肤光老化方面的良好应用前景，本次研究对四种典型食源性肽进行口服实验，评价其对于光老化皮肤的改善效果。

皱纹及屏障功能是皮肤老化的主要指标之一，本研究参照相关文献[10，18]，将形态学定性描述与感官评分相结合，使皱纹评价在缺乏专门仪器的情况下能够进行量化评价，定量评价皮肤皱纹形态学的改变。等级量表可将单纯肉眼观察的现象量化，便于分析处理因素对研究对象的作用，亦可用于评判药物疗效，国外常用此类量表对皮肤的皱纹、松弛等状态进行评估。采用光老化皮肤水分和油脂含量评价其屏障功能的恢复情况。结果表明，4种食源性肽均可在一定程度上改善皮肤光老化皱纹，修复皮肤光损伤，且存在种类和剂量差异，其中以样品2高浓度效果最为明显，其次是核桃肽和样品1，样品3表现最差，本研究结果为产品开发奠定了实验基础。

另，皮肤表观状态与皮肤水油屏障功能密切相关，良好的皮肤外观取决于皮肤水分和油分屏障功能平衡。皮肤角质层细胞是抵御外界损伤的第一道防线，在光老化进程中，紫外线可通过红斑形成、表皮增殖、色素沉着等方式对皮肤屏障功能产生影响，使角质层细胞间粘附能力降低，引起皮肤“砖墙结构”破坏，皮肤屏障功能受损，水分和油脂丢失率增加，从而引发和加剧表观形态劣化[2-4，8]。本研究证明，与空白组相比，模型组大鼠皮肤水分和皮脂流失率显著高于空白组，表明模型组大鼠皮肤的水和油脂屏障功能严重受损，活性肽口服干预后皮肤水分和油脂含量总体呈量-效关系上升，表明活性肽在不同程度上恢复了皮肤屏障功能。基于结构与功能的密切相关性，关于活性肽对皮肤结构的影响有待进一步深入研究。

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[收稿日期]2017-03-10 [修回日期]2017-06-27

编辑/张惠娟endprint