固相萃取-高效液相色谱同时测定沼液中3种四环素类和6种磺胺类抗生素

贺南南， 管永祥， 梁永红， 吴田乡， 赵海燕*, 罗朝晖*， 顾祖丽, 吴 昊

(1.南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 210095；2.江苏省耕地质量与农业环境保护站，江苏南京 210036；3.江苏省互联网农业发展中心，江苏南京 2100361)

随着集约化畜牧养殖业和生态农业的持续性发展，人们对发展沼气生态农业的热情越来越高。目前，主要以畜禽粪便作为发酵原料的沼液，因其含有植物生长的各种养分[1]，经常被作为生物有机肥料施用到农田中。在畜牧养殖业中，由于抗生素具有能促进动物生长、预防动物疾病、提高饲料利用率等特点，因而被长期广泛使用，并且滥用情况十分严重[2]。然而，抗生素大多不能被动物完全吸收，主要以母体或代谢物的形式排出体外[3]，并随畜禽粪便进入沼气发酵过程中，导致沼液中可能存在较高浓度的抗生素残留。此类沼液一旦施用到农田上，将会对生态环境和人体健康造成严重威胁[4]。因此，沼液基质中抗生素的研究逐渐成为了热点。

目前，对抗生素的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)和高效液相-串联质谱法(LC-MS)[5]。LC-MS法虽可提高定量分析的精密度、灵敏度，但操作复杂且检测成本高[6]，HPLC技术与其相比具有低廉的检测费用、易于操作且检测速度快的特点，已成功用于不同环境基质中抗生素的定量分析[7 - 10]。然而，利用HPLC法分析沼液中的抗生素的报道较少。本研究中选用以往研究中检出率和检出浓度较高的3种四环素类(TCs)和6种磺胺类(SAs)抗生素作为目标分析物，优化了固相萃取净化及HPLC法测定条件，建立了一种同时测定沼液中上述9种抗生素的方法。结果表明，该方法可成功应用于实际沼液中目标抗生素的测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1206高效液相色谱仪(美国，安捷伦公司)；真空泵、十二孔固相萃取装置(东康科技有限公司)；超声波清洗仪(昆山禾超声仪器有限公司)；SAX 和HLB固相萃取柱(3 mL/60mg，月旭科技股份有限公司)；pH计(德国，Sartorius公司)；超声清洗仪、超纯水器(南京易普易达发展有限公司制造)；万分之一天平(SHIMADAU公司);旋转蒸发器(德国,BUCHI公司)。

盐酸土霉素(OTC)、盐酸四环素(TC)、盐酸金霉素(CTC)、磺胺嘧啶(SDZ)，磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲基嘧啶(SDMD)、磺胺异恶唑(SMX)、磺胺吡啶(SPD)标准品，均购于上海瑞永生物科技有限公司，纯度为98%。标准品贮备液：分别称取0.0100 g 的OTC、TC、CTC、SDZ、SMZ、SPD、SMR、SDMD、SMX标准品，加入少量甲醇溶解，用超纯水稀释定容至100 mL棕色容量瓶，配制成100 mg·L-1的储备液，置于4 ℃冰箱保存。使用时用超纯水稀释至所需浓度。甲醇、乙腈为色谱纯(Merk公司)，甲酸、NaOH、柠檬酸、Na2HPO4、Na2EDTA、HCl等均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 样品的采集与处理

沼液样品采自于南京市郊区3个大中型沼气工程。以牛粪为发酵原料的沼液采自南京市浦口区永宁镇友联村；以猪粪为发酵原料的沼液采自南京市浦口区大林养殖场；以鸡粪为发酵原料的沼液采自南京市江宁区新洲蛋鸡养殖场。多点收集新鲜沼液并混合均匀成为一个沼液样品，避光密封，带回实验室在室温条件下保存。

采集的沼液先通过滤纸过滤除去悬浮物，再通过0.7 μm玻璃纤维过滤后，准确量取滤液50 mL到烧杯中，加入0.25 g的Na2EDTA，用HCl调节样品pH=4左右。滤液经过漩涡均质后，以1 mL·min-1的速率通过Oasis HLB固相萃取柱(Oasis HLB固相萃取柱使用前，先后用6 mL甲醇、6 mL超纯水、6 mL HCl(pH=4)进行预处理)，进行富集后，用6 mL超纯水清洗固相萃取柱，并真空干燥30 min。最后用6 mL 甲醇缓慢洗脱到10 mL离心管中，将收集的洗脱液在40 ℃水浴条件下旋转蒸发至近干，用2 mL超纯水复溶，超声 5 min促溶。以上溶液均过0.22 μm水系滤膜后，置于棕色玻璃瓶中待测。

1.3 高效液相色谱检测条件

色谱柱：Shim-PackVP-ODS柱(250×4.6 mm,5 μm)；流动相：0.1%甲酸-乙腈(81∶19，V/V)，流量1.0 mL·min-1；进样量20 μL；柱温25 ℃；紫外检测波长270 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1检测波长的确定研究表明，TCs[11]与SAs[12]在270 nm波长附近具有强烈的紫外吸收。在本实验中，以 270 nm为检测波长对9种目标抗生素同时进行检测时发现，270 nm 时9种抗生素的响应较强，且分布相对均匀。因而，本研究选择以270 nm 作为检测波长。

2.1.2流动相的选择与配比据报道[13 - 15]，0.1%甲酸水溶液和乙腈的二元流动相体系可用于多种抗生素的同时检测，但大部分都是梯度洗脱程序，过程繁琐，而采用等度洗脱鲜有报道。在本实验中发现，当体积比为81∶19的0.1%甲酸水溶液和乙腈等度洗脱时分离效果最佳。

2.1.3柱温的选择研究发现柱温会极大程度地影响待测组分的分离效果。实验结果表明，柱温25 ℃时，不仅使得3种TCs和6种SAs达到了最大程度的基线分离，而且对色谱柱和仪器会起到良好的保护作用。而当柱温低于或者高于25 ℃时，TC和OTC、SMZ和SPD均发生了部分信号重叠。

2.1.4流动相流速实验发现流动相流速在0.5～1.2 mL·min-1范围内对于抗生素的分离效果影响不大，兼顾分离度、分离时间及柱效，本实验选择1.0 mL·min-1为最佳流速。

2.1.5色谱柱的选择本研究分别对安捷伦公司的Agilent XDB-C18柱(250×4.6 mm,5 μm)和日本岛津公司的Shim-PackVP-ODS柱(250×4.6 mm,5 μm)的分离效果进行对比。结果表明，Agilent XDB-C18色谱柱只能分离出8种抗生素，色谱峰分布不均匀且严重偏离基线。而 Shim-PackVP-ODS色谱柱可成功分离9种抗生素，且峰形良好。

2.1.6方法线性范围、定量下限及精密度在最佳实验条件下，以质量浓度(c)为横坐标，相应峰面积(S)为纵坐标，得到了3种TCs和6种SAs的线性范围，结果见表1。9种抗生素在0.02～10 mg·L-1范围内与其峰面积呈良好的线性关系，R2均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)所对应的浓度为方法检出限，9种抗生素的检出限范围为2.8～21.0 μg·L-1。同已有其它基质中TCs和SAs分析方法的检出限[16 - 18]相比，本方法检出限能满足要求。选定某一浓度的混合标准样品，在最适宜条件下连续进样10次分离测定，9种抗生素的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)分别不高于0.66%和4.3%。

表1 目标化合物的回归方程、相关系数、方法检出限及精密度(n=10)

2.2 SPE净化过程的优化

2.2.1固相萃取柱选择本实验将20 mL 2.0 mg·L-1混合标准溶液分别选用 SAX和HLB联用小柱和HLB小柱进行过柱，结果显示SAX和 HLB联用小柱的9种目标抗生素回收率在76.6%～89.6%范围。 HLB小柱的回收率范围为73.0%～92.7%。其中，OTC、CTC、SMZ、SDMD、SMX的回收率高于SAX和 HLB联用小柱，这可能是由于SAX 柱持留了部分的目标物，阻碍了抗生素的洗脱效率。故本实验选择HLB 小柱净化样品。

2.2.2洗脱溶剂和洗脱体积将混合标准溶液用超纯水稀释，使各目标物以 1 mg·L-1浓度过HLB柱，每个样品重复3次，选用甲醇、乙腈做为洗脱剂。结果表明，甲醇洗脱时样品9种目标抗生素的回收率均高于乙腈洗脱时的回收率，所以在本研究中选用甲醇对沼液实际样品进行洗脱。试验了甲醇洗脱体积对洗脱率的影响，当甲醇洗脱量为6 mL时目标物洗脱率达最高值，7 mL基本保持稳定，所以确定最佳洗脱体积为 6 mL。

2.3 实际沼液中的条件优化

图1 目标化合物在不同样品pH下的回收率Fig.1 Recoveries of Analytes at different pH values

2.3.1样品pH值实验中将加标浓度为0.1 mg·L-1沼液样品50 mL用HCl调节pH至1～7范围,比较不同pH下样品的回收率情况。如图1所示，pH为1～4时，样品总体的回收率随着pH升高而升高，沼液样品在pH=4时，抗生素的回收率均达到最大值，除了SMZ和SMX，回收率范围在84%～95%。而随着pH的升高，部分或整体的抗生素的回收率呈现下降的趋势。这可能是由于TCs和SAs属于两性化合物，与它们的pKa相关。因此，本研究中将沼液样品pH调至4后再过固相萃取小柱富集。

2.3.2提取剂的选择本研究将50 mL加标水平为1、2 mg·L-1的沼液样品调至pH=4，按照上述萃取过程萃取并测定，比较了Na2EDTA-McIlvaine 缓冲溶液(pH=4)和单独使用Na2EDTA溶液提取沼液各目标物的回收率，每个样品重复测定3次，结果表明Na2EDTA 溶液提取OTC、SDZ、SMZ、SDMD比Na2EDTA-McIlvaine缓冲液提取效果好，可能是由于Na2EDTA-McIlvaine缓冲液易堵塞固相萃取装置。经综合考虑本实验使用Na2EDTA溶液作为沼液中3种TCs和6种SAs的提取剂。

2.4 方法精密度及加标回收率

取实际沼液样品，分别制得浓度为0.05、0.1、0.2、0.5 mg·L-1的加标样品，按照上述的提取方法和色谱条件进行前处理和测定，外标法定量，每个浓度水平重复测定3次。3种沼气样品液中各目标物的平均回收率在74.2%～102.9%之间，相对标准偏差(RSD)小于10%。表2为猪粪发酵沼液中各目标化合物的加标回收率；图2为0.5 mg·L-1加标水平样品的色谱图。由图2可见，各目标物的色谱峰得到良好的分离。

表2 目标化合物的回收率和相对标准偏差精密度(n=3)

2.5 实际样品的测定

将实际采集的以猪粪、鸡粪和牛粪为发酵原料的沼液，照上述预处理方法和色谱条件进行提取检测分析，其中以鸡粪为发酵原料的沼液的色谱图见图3。结果表明，以猪粪为发酵原料的沼液中检出的SDZ、 SMZ 、SMR 3种抗生素，其含量范围为34.9～118.5 μg·L-1；以牛粪为发酵原料的沼液中检出的OTC、CTC、SPD、SMX 4种抗生素，其含量范围为21.7～51.9 μg·L-1；以鸡粪为发酵原料的沼液中检出的OTC、TC、SDZ、SMZ、SMR、SMX 6种抗生素，其含量范围为28.5～125.5 μg·L-1，其中SMZ的残留量最高。

图2 沼液加标样品(0.5 mg·L-1)中目标化合物的色谱图Fig.2 Chromatograms of analytes in a spiked sample(0.5 mg·L-1) of biogas slurry

图3 以鸡粪为发酵原料的沼液中目标化合物的色谱图Fig.3 Chromatogram of analytes in biogas slurry samples fermented with chicken dung

3 结论

本研究建立了一种 SPE-HPLC 法同时测定沼液中3种四环素和6种磺胺类抗生素的方法，该方法的检出限为2.8～21.0 μg·L-1。方法对实际沼液中目标物的回收率范围为74.2%～102.9%。经过对南京以猪粪、牛粪、鸡粪为发酵原料的3个沼气工程的沼液样品中3种TCs和6种SAs的残留分析，发现这3种不同沼液环境中磺胺嘧啶和磺胺甲恶唑检出频率最高，而且磺胺甲恶唑在以猪粪、鸡粪为发酵原料的沼液中检出浓度最大。