密度泛函理论辅助研究大黄素型蒽醌化合物电喷雾质谱的裂解过程

牛燕燕, 陈光英， 罗由萍， 郑彩娟， 周学明

(海南师范大学化学与化工学院，海南海口 571158)

图1 大黄素型蒽醌化合物的分子结构Fig.1 The molecular structure of emodin-type anthraquinone compounds

蒽醌是广泛存在于植物中的一类化合物，也是许多中药(大黄、何首乌、芦荟等)的有效成分，大黄素型蒽醌化合物则是蒽醌衍生物中最大的一类，大多具有抗菌、抗肿瘤、致泻等多种生物活性。据文献报道，大黄素具有血管舒张，免疫抑制，保肝护肝和抗肿瘤等功效。Demirezer等研究发现大黄素及其类似物对多种肿瘤细胞有细胞毒作用[1 - 3]。此外，羟基蒽醌也是重要的商业染料，具有其他染料无法比拟的坚牢度，在造纸、信息存储等方面也有着广泛的应用。红树林高盐、高温特殊的生长环境，蕴藏了丰富而具有独特代谢途径和遗传背景的微生物资源，其代谢产物结构骨架新颖，种类多样，并有多种杂原子取代，为新药的先导结构提供了重要的资源[4 - 9]。

本研究拟通过电喷雾离子阱质谱(Electrospray Ionization Ion Trap Mass Spectrometry，ESI-IT-MSn)，结合量子化学密度泛函理论(DFT)计算方法，对红树植物尖瓣海莲(Bruguierasexangulavar.rhynchopetala)内生青霉菌Penicilliumsp.代谢产物中三个大黄素型蒽醌化合物(图1)质谱碎片结构及碎裂过程进行研究，以期为此类化合物的结构鉴定及复杂样品的快速检测提供理论参考和质谱依据[1,10]。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Bruker esquire HCT电喷雾离子阱质谱(德国,布鲁克公司)，配备电喷雾离子源，美国KD scientific注射泵，esquire Control质谱工作站等；Bruker AVANCE II 400M核磁共振仪(瑞士,布鲁克公司)；超净工作台(苏净集团安泰公司产品)。

化合物均由本实验室培养的内生青霉菌Penicilliumsp.代谢产物中提取分离，经核磁共振确定结构。甲醇(色谱纯,美国Sigma-aldrich公司)；液氮、氦气(99.999%，海南金厚特种气体有限公司)，其余试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 菌株的分离纯化与发酵培养

尖瓣海莲(Bruguierasexangulavar.rhynchopetala)采摘自海南东寨港自然保护区。新鲜叶片经无菌水冲洗，75%乙醇浸泡30 s(除去表面微生物)后，无菌水再次冲洗3次。叶片组织切块培养于PDA培养基28 ℃恒温倒置培养，经分离纯化后，对获得的一株菌株经形态学和分子生物学鉴定为青霉属真菌。

发酵培养:低温保存的菌种经复活后，转移到装有100 mL马铃薯液体培养基的锥形瓶(容量为500 mL)中，摇床恒温(28 ℃)培养3 d，即得种子培养液。将5 mL种子培养液转移到装有400 mL已灭菌PDA培养基的锥形瓶(容量为1 000 mL)中，室温静置培养40 d。

1.3 实验条件

1.3.1样品提取微生物代谢产物经乙酸乙酯萃取、浓缩得浸膏。由硅胶柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯和氯仿/甲醇梯度洗脱，收集各组分，经反复柱层析、重结晶等方法纯化得到化合物JGWY-C、JGWY-D和JGWY-B。

1.3.2质谱条件电喷雾离子源，采用负离子模式；扫描速度26 000m/z/s；样品通过蠕动泵以4 μL/min 的速率送入离子源；喷雾电压3 500 V，干燥气N2温度为300 ℃，流速8 L/min，雾化气N2压力为6.9×104Pa；引入少量氦气(约5.0×105Pa)作为碰撞气，同时可以提高离子的诱捕效率；多级质谱的碰撞能量为0.8 V。

1.4 量子化学计算

根据密度泛函理论(DFT)，采用Gaussian 09程序[11]，在B3LYP/6-31G基组水平，对各化合物分子及碎片离子的初始几何构型进行全自由度优化和频率计算，确认无虚频后，确定其稳定、精确的几何构型，计算各分子或离子结构的Mulliken电荷分布，并推断化合物分子的裂解机理[12 - 14]。

图2 化合物JGWY-C、JGWY-D和JGWY-B的CID-MS扫描Fig.2 CID-MS of compounds JGWY-C,JGWY-D and JGWY-B

2 结果与讨论

在正离子模式一级质谱中，三个化合物均未表现出明显的准分子离子峰。在负离子模式一级质谱中，均以[M-H]-准分子离子形式存在(图2)。因为此类化合物中含有酸性基团(酚羟基)，更容易去质子化，适合负离子模式，实验结果与文献报道[15 - 16]相符。我们运用DFT理论对可能的去质子化模式进一步研究[17]:从能量上看，化合物JGWY-C P3模式、JGWY-D P5模式和JGWY-B P3模式中，酚羟基氢去质子化过程所需的总能量最低，更有利于形成热力学稳定产物PC、PD和PB(图3)，这主要是由于苯环上羟基、甲基、羟甲基等官能团与苯环产生共轭效应影响电荷分布，进而影响活性位点去质子化能量。Mulliken电荷分布(表1)也说明，这几种模式下正负电荷差大，离子化程度高，所对应的O-H键更容易断裂[13]。

图3 质子解离能计算Fig.3 Caculated values of the deprotonation energy for JGWY-C,JGWY-D and JGWY-B

Distribution of Mulliken charge of O/HJGWY-CJGWY-DJGWY-BP1-0.566 e/0.370 e-0.574 e/0.371 e-0.565 e/0.370 eP3-0.615 e/0.375 e-0.568 e/0.376 e-0.616 e/0.375 eP5--0.617 e/0.374 e-P6---0.617 e/0.370 eP8-0.567 e/0.370 e-0.575 e/0.368 e-0.567 e/0.372 e

以此为基础，探讨化合物碰撞诱导裂解(CID，Collision-Induced Dissociation)规律，分析CID-MS2质谱图(图4)可知，化合物二级裂解过程中均丢失质量数为28 u和44 u的中性小分子，形成主要的碎片离子峰，进一步研究这些碎片可能的形成过程。

图4 化合物CID-MS2扫描Fig.4 CID-MS2 of the selected precursors

2.1 PC、PD和PB丢失CO、CO2裂解机理

准分子离子PC、PD和PB在CID-MS2中都有脱去小分子CO和CO2的特征裂解，结合其结构特点，计算PC、PD和PB的Mulliken电荷分布[13,18]，我们发现都是A环上羟基连接的碳碳键更容易断裂，B环受甲基或羟甲基的影响而离子化程度较弱。以PD为例(图5)，P3位羟基连接碳与邻位碳正负电荷差最大，离子化程度高，更容易断裂形成脱去CO的特征离子碎片；P1位和P8位羟基碳氧键离子化程度较高，可能形成脱CO2的特征离子碎片，结合文献[19,20]的分析，认为CO2脱除是A环间位酚羟基形成的(图5)。有报道[20]认为，CO的脱除是C环羰基裂解形成，因为该裂解方式化学键键能更小，得到的产物能量最低，体系结构更稳定，但考虑到空间位阻效应和电荷分布情况，作者认为A环更容易脱除CO，裂解产物应该是克服了较高的能垒形成过渡态并丢失一分子CO形成的。

图5 去质子化离子PD丢失CO和CO2的裂解反应Fig.5 Cleavage reaction of PD for the elimination of CO or CO2

2.2 PB脱H2裂解机理

母离子PB在CID-MS2中，除了裂解产生脱去小分子CO和CO2的特征离子峰外，还出现了具有较高丰度的质荷比相差 2 u的特殊碎片离子峰，比较PC、PD与PB的结构差异，推测该碎片离子是B环上6位相连的羟甲基脱H2形成。若-CH2OH与B环7位氢反应脱去H2形成碎片离子FB1(图6)，那么该结构由于四元环张力作用而不稳定。因此推测是-CH2OH自身脱去H2形成醛基，即碎片离子FB2。能量计算结果也表明，FB2的能量比FB1低43.00 kcal/mol，稳定性更高，是形成碎片离子的有利途径。

图6 PB丢失H2的裂解途径Fig.6 Fragmentation pathway of PB for the elimination of H2

2.3 子离子CID-MS3裂解

各化合物CID-MS2所得的子离子碎片进一步裂解，都得到了再次脱CO或CO2的碎片离子峰。以化合物JGWY-D为例，CID-MS3裂解(图7)可观察到脱CO、CO2和甲基的碎片离子，结合CID-MS2裂解规律的分析和Mulliken电荷分布计算，推测CID-MS3的裂解是在A环或B环酚羟基诱导下形成的(图8)。结合化合物结构特点判断，A环或B环的酚羟基是脱CO或CO2的贡献基团，因此逐级裂解脱除CO和CO2的裂解规律可作为多羟基大黄素型蒽醌化合物的特征裂解方式之一，应用于复杂样品中此类化合物的快速检测及药代动力学研究等。

图7 化合物JGWY-D CID -MS3扫描Fig.7 CID -MS3 of JGWY-D of the selected precursors

图8 JGWY-D CID-MS3裂解途径Fig.8 Fragmentation pathway of JGWY-D with CID-MS3

3 结论

本文讨论了大黄素型蒽醌化合物ESI-IT-MSn碰撞诱导裂解反应。研究表明，大黄素型蒽醌化合物含有多个酚羟基，具有一定的酸性，同时由于苯环所连接的官能团个数和共轭效应强弱不同，导致酚羟基去质子化位点不同，进而影响母离子的进一步裂解。CID-MS2条件下，大黄素型蒽醌化合物A环和B环羟基裂解丢失CO和CO2。CID-MS3条件下，苯环上酚羟基进一步裂解脱除CO和CO2。此外，去质子化离子PB在CID-MS2时还会裂解脱去特异性小分子H2，理论计算和结构分析表明，应该是6位相连的-CH2OH 自身脱H2形成醛基。通过研究大黄素型蒽醌类化合物ESI-IT-MSn裂解规律，以期为此类化合物的结构鉴定和检测提供有用的质谱依据。