红枣环磷酸腺苷的研究进展

,, ,, ,,洪斌,*

(1.新疆农垦科学院农产品加工研究所,新疆石河子 832000;2.新疆农垦科学院农产品加工重点实验室,新疆石河子 832000;3.鹤壁职业技术学院,河南鹤壁 458030)

红枣环磷酸腺苷的研究进展

代文婷1,2,王永刚3,杨慧1,2,贾文婷1,2,吴宏1,2,金新文1,2,吴洪斌1,2,*

(1.新疆农垦科学院农产品加工研究所,新疆石河子 832000;2.新疆农垦科学院农产品加工重点实验室,新疆石河子 832000;3.鹤壁职业技术学院,河南鹤壁 458030)

环磷酸腺苷(cAMP)是机体内一种重要的生理活性物质,能调节机体细胞的多种功能活动,开发利用前景广阔。该文综述了近年来环磷酸腺苷在提取、分离纯化、检测方法及临床、功能性食品中应用价值等方面的研究进展,论述了环磷酸腺苷的发展趋势和应用前景,为进一步开发枣资源和环磷酸腺苷的深入研究提供参考。

红枣,环磷酸腺苷,提取,分离纯化,检测,应用价值

新疆红枣栽培面积近50万公顷,产量达300万吨[1],红枣具有高营养价值和药效,含有多种生物活性成分,能调节机体新陈代谢、调节体质、促进体能提高,其中最为突出的重要生命物质就是环磷酸腺苷(cAMP),研究证实,包括癌症、高血压、冠心病和心肌梗死等多种疾病均与cAMP代谢有关[2-3]。传统获取cAMP的方法有微生物发酵法、化学合成法和天然产物提取法。但微生物发酵法培养cAMP周期长,成本较高,产量较少,产物还可能带有菌体代谢物;化学合成法存在化学试剂残留隐患,易污染环境。渐渐人们将着眼点转向天然原料,而枣中cAMP含量是180多种天然植物中最高的,达100～600 nmoL/g[4],具有极高的开发利用价值,逐步成为研究的热点对象。本文基于cAMP各方面的研究成果,结合最新研究动态,从红枣cAMP的提取、分离纯化、检测方法和临床、功能性食品中应用价值等方面研究进展作一综述,以期为红枣cAMP进一步研究和开发利用提供参考。

1 cAMP的生理活性

cAMP是核苷酸的衍生物,由腺嘌呤、核糖和磷酸组成,磷酸与核糖的3′,5′位相连成环状,由此称为环磷酸腺苷,结构式如图1。它是蛋白激酶致活剂,是最重要的胞内信使之一,能参与细胞分裂与分化、形态形成、类固醇生成、糖原和脂肪分解等多种生理生化过程,在基因表达中发挥至关重要的作用,能抑制细胞增殖、癌细胞、过敏性疾病等,对神经系统也有调节作用,还能诱导激素或酶的合成,促进机体合成代谢[5-9];还有研究表明,cAMP具有扩张血管、舒张平滑肌、激活蛋白、改善肝功能,改善抑郁症消化功能障碍等多种活性[10-12]。无论在保健还是临床应用领域,对cAMP的研究意义十分重大。

图1 环磷酸腺苷结构图Fig.1 Structure diagram of cAMP

2 cAMP的提取、纯化与检测

2.1cAMP的提取方法

2.1.1 溶剂提取法 目前,主要采用溶剂提取法提取枣cAMP,即乙醇提取和水浸提,又因超声波具有空化作用和机械振动作用,能加速目标成分进入溶剂,促进其释放和提取[13-14];微波辐射能更快且均衡地加热物料,促使细胞膨胀破裂,有效成分得以快速释放,利于目标产物浸出[15],若辅以超声波或微波处理一定程度上可提高cAMP的提取效果。

胡云峰等人[16]利用超声波辅助水浸提灵武长枣cAMP,工艺优化后cAMP提取量为331 μg/g;严静等人[17]对超声波辅助提取赞皇枣cAMP进行了研究,结果证明超声波辅助提取法所得cAMP提取量为644.46 μg/g,比普通水浴法提取量454.99 μg/g高41.6%;蒋劢博[18]同样采用超声波法辅助提取新疆红枣cAMP,在最佳工艺参数下,cAMP提取量达502.2 μg/g,且首次提出超声处理方式(超声工作时间与间歇时间之比)对cAMP提取率有重要影响,提取率高达96.80%;王丽霞[19]依据相关研究[20-24]建立了微波辅助提取和田玉枣cAMP的方法,cAMP产量达795.63 μg/g,比传统溶剂法、超声波辅助法产量分别提高了28.26%和3.07%。

微波-超声波萃取技术将微波与超声波有机结合,实现优势互补,具有杂质少、能耗低、无污染、效率高和不破坏有效成分等特点,从而获得更高的提取效率,此技术虽然应用于cAMP的提取研究报道较少,但被认为是最有前景的方法[25-27]。高侨君[28]采用微波-超声波辅助提取法、超声辅助提取法和水提法分别提取金丝小枣中的cAMP,在最优工艺条件下得出微波-超声波辅助提取法提取率达90.83%,比超声辅助提取法、水提法提高了14.37%及28.66%。

2.1.2 酶法 酶法作用于植物时可破坏其细胞壁结构,促使有效成分释放而提高产率。许牡丹等人[29]利用超声波辅助纤维素酶提取木枣cAMP,在最佳提取条件下,木枣cAMP的提取量达154.3 μg/g,高于普通水浴法、单一酶法及超声波法的提取量;Chunxia Wang等[30]利用果胶酶水解枣浆提取cAMP,得到cAMP粗提物含量为36%,纯化后含量达95%;段禹轩[5]为利于抽提和分离cAMP,采用复合果浆酶水解红枣浸提液中的纤维素、胶原蛋白等,经纯化后cAMP纯度达95%。

此外,超临界流体萃取技术(SCF)也是近20年来分离领域中出现的高新技术,虽然在产物提取率上得到大大提高,但设备要求复杂,溶剂选择范围窄,建立大规模生产线有难度。国内学者孟伊娜等人[31]以干枣粉为实验原料,10%乙醇作为萃取液,采用超声超临界浸提cAMP,提高了cAMP提取率,将常规方法的浸提率由85%提高至95%以上。国内外,超声波、微波辅助萃取法以及SCF广泛应用于天然产物化学成分提取,但相关红枣cAMP提取报道较少,采取两种或多种方法联合使用,可大大提高cAMP提取率,达到物尽其用的效果。

2.2分离纯化方法

2.2.1 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂法是利用大孔吸附树脂对目标物进行吸附和筛选以达到分离纯化的目的,其具有良好孔状结构、比表面积大、选择性强、吸附迅速且吸附容量大、解析条件温和及环保等特点[32-33]。目前,对cAMP的分离纯化主要利用大孔吸附树脂法。夏泉鸣等人[34]用D13型树脂纯化大枣中的cAMP,以0.05 mol/L HCl为洗脱剂,流速1.5 mL/min时,cAMP纯度达37.5%;王荔等人[35]选用AB-8大孔吸附树脂纯化cAMP,以1 BV/h的流速上样15 μg/mL的cAMP提取液64 mL,经30%、流速0.5 BV/h的乙醇洗脱4 h,获得cAMP纯度为58.2%;王维有等人[36]则采用D101型大孔树脂分离纯化大枣中cAMP,上样液浓度20 μg/mL,上样体积70 mL,上样流速1.5 BV/h,40%乙醇以1BV/h 流速洗脱180 min,cAMP纯度达68.5%±3.4%,与王荔等人的研究相比,此纯化方法可得到纯度更高的cAMP提取物。由此看来,不同研究者获得的最佳大孔树脂型号及纯化方案有所不同,这可能与cAMP提取方式和洗脱剂等材料的不同有关,故实际应用中可根据不同情况选择合适的洗脱剂和树脂型号。但大孔树脂依然存在再生较麻烦、重复利用周期短和物理化学稳定性差等缺点。

2.2.2 硅胶柱层析法 硅胶柱层析是利用流动相中的各组分对吸附剂的吸附和解析能力的差异,使它们在柱内移动速度不同,从而达到分离的目的。米东等[37]用硅胶柱层析法替代薄层色谱法(TLC)纯化红枣cAMP,获得纯度98.43%的cAMP,比之前提高了1.47%;同样有研究者[30]采用硅胶柱层析法纯化椰枣cAMP,含量由36%提高到95%。此法操作简单,易于工业化生产,具有重要应用价值。反向硅胶层析法预处理、再生较简单,装柱方便,重复利用周期较大孔树脂长,物理化学稳定性也较好,分离效率较高。另有研究者[38]采用反相硅胶纯化大枣cAMP,在最佳工艺参数下,cAMP纯度由0.098%提高到44.69%,比崔志强[39]用HPD-400型大孔吸附树脂纯化后高12.24%。然而大多研究表明,仅靠单一的色谱技术难以实现混合物的分离,大多数化合物的分离需要多种色谱技术的相互结合才能实现,环磷酸腺苷的分离纯化也可尝试此方法。

2.3cAMP的检测方法

cAMP的检测主要有纸层析法、薄层色谱法、蛋白结合法和紫外分光光度法等,但这些方法均不同程度地存在检测时间长、分离效果不理想、重现性差、灵敏度低和操作繁琐等问题[40],随着分析方法的逐步改进,高效液相色谱法(HPLC)以其分离、定量分析性能高,分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广等特点,逐步在分析领域内占据重要的地位[41-42],HPLC法在cAMP检测中也已得到深入应用。

史红梅等人[43]建立了HPLC测定枣汁中环磷酸腺苷的方法,用Shim-Pack VP-ODS色谱柱,流动相为甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(30∶70,v/v),检测波长260 nm,流速0.6 mL/min,回收率101.5%,该法简便,灵敏,重现性好,可快速测定含有环磷酸腺苷的溶液和其制剂;郜文等[44]成功建立了大枣cAMP的检测,平均回收率100.35%,RSD 1.58%,该法快捷准确、灵敏度高、重复性好;张岩等人[45]利用高效液相色谱法建立了同时测定浓缩枣汁中cAMP和环磷酸鸟苷(cGMP)含量的检测方法;另有研究者[46]将超高效液相色谱法(UHPLC)法应用于大枣中环核苷酸的检测,分离效果较好。此外还有利用HPLC法和UHPLC测定大枣中cAMP和cGMP含量,优化了检测参数,提高了方法的灵敏度和准确度,并通过比较得出UHPLC法明显具有优势[47]。

3 cAMP的应用价值

3.1临床中的应用价值

cAMP在临床应用中,国内外已做了许多研究。在国内,刘庆春等[48]研究认为cAMP提取液对人体有明显抗疲劳、提高机体体能和耐力的作用;段霞光等[49]认为在肾脏移植手术中静脉注射cAMP可以明显改善肾移植患者术后肾功能;胡晨旭等人[50]研究结果表明cAMP与肿瘤的发生和发展密切相关,且cAMP的含量与肿瘤的治疗呈正相关关系,此结论对cAMP在临床应用中有重要意义;在国外,Meng Gao等[51]研究发现cAMP可以通过激活Epac,抑制卵巢癌细胞的增殖;M Ionta等[52]发现将RA和cAMP联合应用于癌细胞时,对癌细胞增殖的抑制和诱导分化作用效果强于分别用RA和cAMP处理的癌细胞;cAMP依赖型蛋白激酶和cAMP在前列腺癌等治疗中也发挥了非常重要的作用[53];Kim MO等[54]研究指出,通过cAMP的有效协调和肌动蛋白细胞骨架重塑可促进ESCs迁移,从而增强伤口愈合;第二信使cAMP、cGMP信号通路对睾丸素的生成有重要作用,Aleksandar Z等[55]发现衰老对cAMP和cGMP的信号传导具有相反作用,衰老可能会导致cAMP信号降低,cGMP信号增强,这项研究有助于治疗与昼夜节律紊乱、衰老和生殖相关的疾病。此外,cAMP与Epac高亲和力地结合后能激活多种下游的信号分子,而这些信号分子可参与多种细胞的生理和病理过程[56]。由此可见,cAMP在临床应用领域具有广阔的应用前景。

3.2功能性食品中的应用价值

枣及其提取物在功能性食品中被大量使用,多数以多糖为标志性成分[57],而关于富含cAMP的功能性食品的报道还不多。张宏刚等人[58]发明了一种制备高含量cAMP的红枣浓缩青汁的方法,cAMP含量高于100 μg/g;另有研究者开发了一种富含红枣cAMP的口服液,并作了稳定性实验,得出口服液在6个月内,常温(35 ℃以下)避光放置比较稳定[5];红枣cAMP还可以作为功能性食品添加剂和医药原料药[28];此外,也有与其他中草药结合、研发生产具备防治心血管病、保肝解毒、糖尿病等方面的药品,充分利用枣这一重要食品药品资源,以满足人们对天然食品、保健功能食品和天然药物日益增长的需求。

4 展望

cAMP是机体内一种重要的生理活性物质,国内外对其生理活性和作用机理进行了大量研究,涉及基因复制、信号表达、疾病治疗等方面,也有研究证明其与过敏性疾病、糖尿病和恶性肿瘤等的发生密切相关。随着人们对健康意识的增强,在研究工作和临床实验中cAMP的需求量会大大增加,所以cAMP的提取、分离纯化工艺及检测方法更需不断改进和优化。在今后研究中,重点集中在如下方面:以往研究中[4,19,59-60]对不同产地、不同成熟期、不同部位的枣cAMP测定时,会发现cAMP含量相差悬殊,为确保枣在应用中的效果,建议对实验中的枣类进行cAMP含量测定,以确定大枣药材中cAMP含量限量,可列入质量控制标准;在红枣cAMP提取、分离纯化和检测方面,可分别探索多种简便、高效的方式方法相结合,从天然产物中分离出高纯度的cAMP,以利于工业化生产。加强红枣cAMP功能性食品开发。枣作为一种药食同源原料,在功能性食品中的开发前景是良好的,cAMP的生物活性已被发掘出来,但其结构与功能方面关系还需强化研究,尤其是药理活性应用及其工业化进程未来还有一段路程[61];针对不同人群,功能性食品开发也更具专一性,红枣cAMP功能性食品会受到越来越多消费者的欢迎,具有巨大经济潜力和市场价值。综上所述为进一步开发枣资源、提高枣附加值提供新途径,推进枣产业健康向上发展。

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ResearchprogressincAMPfromredjujube

DAIWen-ting1,2,WANGYong-gang3,YANGHui1,2,JIAWen-ting1,2,WUHong1,2,JINXin-wen1,2,WUHong-bin1,2,*

(1.Instiute of Agro-Products Processing Science and Technology,Xinjiang Academy ofAgricultural and Reclamation Science,Shihezi 832000,China;2.Key Laboratory of Agro-Products Processing Science and Technology,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,Shihezi 832000,China;3.Hebi Polytechnic,Hebi 458030,China)

Cyclic adenosine monophosphate(cAMP)is an important physiologically active substance in the body,which can regulate the various functional activities of the cells and has a bright future in development and utilization prospects. This paper reviews the progress in extraction,separation and purification,detection method and the application value of clinical,functional food of cAMP in recent years,discuses the development trend and application prospect of cAMP,and provides a reference for the further development of jujube resources and research of cAMP.

red jujube;cAMP;extraction;separation and purification;detection;application value

TS209

A

1002-0306(2017)19-0332-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.061

2017-03-08

代文婷(1988-)，女，硕士研究生，助理研究员，研究方向：果蔬加工与副产物综合利用，E-mail:wendydai310@126.com。

*通讯作者:吴洪斌(1980-)，男，硕士研究生，副研究员，研究方向：农产品加工与贮藏研究，E-mail:woo2007@foxmail.com。

兵团工业科技攻关与成果转化(2015AB030)。