复合菌发酵对野生猕猴桃果酒风味物质的影响

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(1.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;2.四川化工职业技术学院,四川泸州 646000)

复合菌发酵对野生猕猴桃果酒风味物质的影响

张晶1,左勇1,*,谢光杰2,张鑫1,孙时光1,瞿娇娇1

(1.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;2.四川化工职业技术学院,四川泸州 646000)

本文主要研究复合菌发酵对野生猕猴桃果酒风味物质的影响。考察了发酵温度、SO2添加量、糖度及酵母菌复合比例对果酒质量的影响,通过正交实验,得到最佳发酵工艺条件为:温度26 ℃,SO2添加量80 mg/L,糖度210 g/L,安琪酵母与酵母菌TP6复合比为2∶1,在此条件下酒精度可达10.6%vol,酒体风味理想。采用复合菌和安琪酵母发酵的果酒,经顶空固相微萃取-气相色谱-质谱鉴定,分别检测到35、24种化合物,并以醇类、酯类为主。

猕猴桃果酒,复合菌,发酵,香气成分

猕猴桃属浆果类水果,芳香多汁,富含糖类、氨基酸、蛋白质、黄酮、多酚、有机酸,尤以维生素C居多,具有抗氧化功效[1]。野生猕猴桃在我国广泛分布于西部和南部山地,在河南、四川等地也有大量野生猕猴桃种植[2]。由于野生猕猴桃易腐烂,存储时间短,用于鲜食又不具优势,每年都有大量果实损失[3]。因此,利用丰富的野生猕猴桃资源,因地制宜开展精深加工,是解决鲜果过剩的有效途径,目前将野生猕猴桃加工生产果酒,已取得阶段性成果。

在果酒生产过程中,菌种将直接决定着产品成本和产品质量[4]。由于单菌种发酵的果酒风味淡薄,不能满足消费者的认可,因此采用复合菌发酵生产果酒,能较好地弥补果酒风味不足的缺陷。在果酒发酵过程中,不同菌种相互作用,能产生丰富的芳香物质和风味成分,赋予果酒特定风味[5-7]。Iris Loira等[8]将粟酒裂殖酵母和德布尔有孢酵母混合菌株用于红葡萄酒连续发酵,能增加多元醇的合成,增加香气。黄国清等[9]探讨几种酵母固定化发酵含酸量较高的西番莲果汁制作干型西番莲果酒的发酵工艺,取得了较好效果。为充分利用野生猕猴桃资源,酿造独具风味的猕猴桃果酒,本研究拟采用复合菌对野生猕猴桃进行发酵,采用正交实验优化野生猕猴桃果酒发酵工艺,并利用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对比分析复合菌发酵果酒和单酵母发酵果酒的香气成分,以探究复合菌发酵对野生猕猴桃果酒品质及风味物质的影响,为野生猕猴桃果酒的进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料和仪器

野生猕猴桃原产地为宜宾市,呈椭球形,长度为5～7 cm,果实平均质量在80 g左右;酵母菌TP6 实验室保存;安琪酵母 安琪酵母(伊犁)有限公司;PDA培养基:马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、水1000 mL;YPD液体培养基:蛋白胨2%,葡萄糖2%,酵母膏1%,pH4.5～5.0。

AR1140电子天平 托利多仪器(上海)有限公司;GZ-250-HS11恒温恒湿箱 韶关市广智科技设备有限公司;YXQ-LS-75S11立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;手持糖度计 成都格纳丝商贸有限公司;XSP-1600X光学显微镜 广州新怡光学显微镜厂家;50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司;Agilent6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司。

1.2野生猕猴桃果酒酿造工艺流程

野生猕猴桃→选果→洗果→破碎打浆→成分调整→主发酵→分离→后发酵→初滤→调整→陈酿→澄清→精滤→装瓶→灭菌[10]

1.3实验方法

1.3.1 野生猕猴桃果浆的制备与酶处理 挑选完整无腐烂的野生猕猴桃,清洗、打浆,用柠檬酸与碳酸钠溶液调整果浆pH为4.0,加入0.6%果胶酶,于45 ℃酶解1.5 h,冷却至常温备用。

1.3.2 酵母菌比例的配制 从斜面挑取少量酵母菌TP6和安琪酵母于YPD液体培养基中,培养1 d,通过血球计数板对酵母菌进行计数,并按预定比例进行混合,使每毫升培养液酵母菌数量达到1×108个。

1.3.3 单因素实验 温度:在装有350 mL野生猕猴桃果浆的锥形瓶中加入白砂糖150 g/L、SO260 mg/L,复合酵母菌2 mL(1∶1),温度控制在20、22、24、26、28、30、32 ℃,发酵10 d,发酵结束时测定果酒酒精度、残糖含量,并对其进行感官评价。

SO2:在装有350 mL野生猕猴桃果浆的锥形瓶中加入白砂糖150 g/L、SO2添加量分别为40、60、80、100、120、140、160 mg/L,复合酵母菌2 mL(1∶1),于24 ℃条件下发酵10 d,发酵结束时测定果酒酒精度、残糖含量,并对其进行感官评价。

糖添加量:在装有350 mL野生猕猴桃果浆的锥形瓶中分别加入白砂糖60、90、120、150、180、210、240 g/L,SO260 mg/L,复合酵母菌2 mL(1∶1),于24 ℃条件下发酵10 d,发酵结束时测定果酒酒精度、残糖含量,并对其进行感官评价。

酵母菌复合比:在装有350 mL野生猕猴桃果浆的锥形瓶中加入白砂糖150 g/L,SO260 mg/L,复合酵母菌分别按4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的量接入2 mL,于24 ℃条件下发酵10 d,发酵结束时测定果酒酒精度、残糖含量,并对其进行感官评价。

1.3.4 正交实验 在单因素实验基础上,设计L9(34)正交实验,研究不同发酵条件对果酒品质的影响。以酒精度、感官评分为考察指标,通过权重计算得野生猕猴桃果酒综合评分。正交实验因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The factors and levels Table of orthogonal experiment

1.3.5 单菌株与复合菌株发酵生产野生猕猴桃果酒香气成分比较 在野生猕猴桃果酒发酵工艺优化基础上,分别向猕猴桃果浆中加入复合菌株和安琪酵母进行猕猴桃果酒发酵。发酵结束时采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对比分析复合菌发酵果酒和单酵母发酵果酒的香气成分。

1.3.6 野生猕猴桃酒样香气成分提取 顶空固相微萃取:用0.45 μm膜过滤酒样,吸取5 mL待测样品于15 mL顶空瓶,加入1 g NaCl,置于恒温磁力搅拌加热平台上。将萃取头插入样品瓶的顶空部分,于40 ℃下吸附30 min。将萃取头插入气相色谱进样口,于230 ℃热解析8 min。

1.3.7 气相色谱-质谱(GC-MS)分析条件 色谱条件:毛细管色谱柱为DB-WAX,规格为60 m×250 μm×0.25 μm;手动无分流进样,进样口温度为230 ℃;程序升温:35 ℃保持3 min,然后6 ℃/min升温到150 ℃,保持1 min,再以12 ℃/min升温到230 ℃,保持5 min;载气:高纯度氦气,流速1 mL/min。

质谱条件:EI电子源,电子能量70 ev,质量扫描范围在20～550 u;离子源温度230 ℃,接口温度230 ℃。

香气物质定性定量分析:利用全离子图谱,结合已有标样的色谱保留时间、质谱信息及NIST05标准谱库,对野生猕猴桃果酒中的挥发性物质进行定性分析。最后采用气相色谱峰面积归一化法确定各挥发性组分的相对含量。

1.3.8 测定方法 酒精度:酒精计法;糖度:高精度手持糖量计;残糖:斐林试剂滴定法;酸度:精密级数字式酸度计直接测定;感官评分[11]。

1.3.9数据分析方法 根据正交试验结果，分别计算酒精度和感官评定隶属度。

酒精度或感官评定隶属度=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中X为待计算隶属度的酒精度或感官评定值，Xmax为正交试验中最大酒精度或感官评定值，Xmin为正交试验中最小酒精度或感官评定值。

酒精度权重[12]取0.4，感官评定权重取0.6，分别对不同发酵条件下的野生猕猴桃果酒进行综合评分，即综合评分=酒精度隶属度×0.4+感官评定隶属度×0.6，采用IBM SPSS Statistics 19对评分结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1单因素实验

在传统溯源过程中，使用人工进行手写记录是生产阶段信息监测的常态，人工手写的方式不但效率较为低下并且往往具有一定的错误率。所以本设计将使用二维码扫码进行数据获取，使得数据的记录方式从人工手写记录转为数字化的方式，来提高数据录入效率和准确率。针对相关数据查询的手机端的实现方式通过不同阶段的扫码来与服务器端自动进行数据获取，从而实现茶叶信息的溯源。手机客户端扫码流程实现界面如下所示。

2.1.1 温度对猕猴桃果酒发酵的影响 温度是影响酵母生长、繁殖、代谢的重要因素。温度过低会抑制酵母的生长、繁殖,造成起酵慢,糖降解速率低;温度过高时,发酵剧烈,易带走果香,酯香形成少,从而导致酒体香气欠缺、粗糙,成品酒的风味和口感较差[12-13]。由图1可知,当发酵温度在20～26 ℃之间时,酒精度逐渐升高,残糖含量逐渐降低,而当发酵温度超过28 ℃,酒精度明显下降。当温度适宜时,复合菌正常产酒,温度过高或过低都会抑制复合菌的发酵,从而影响糖向酒精的转化。

图1 不同温度对发酵结果的影响Fig.1 The effects of different temperature on fermentation results

2.1.2 SO2添加量对发酵结果的影响 在果汁发酵前,通常要加入适量的SO2,以抑制杂菌的生长、繁殖与代谢,保证发酵的顺利进行,此外,SO2还有澄清、抗氧化、增酸、使色素溶出等作用[14]。由图2可知,当SO2添加量小于60 mg/L时,酒精度随着SO2的增加而上升,当SO2添加量超过80 mg/L时,酵母受到抑制,酒精度开始下降,残糖含量也逐渐增加。

图2 不同SO2添加量对发酵结果的影响Fig.2 The effects of different amounts ofSO2 on fermentation results

2.1.3 糖度对发酵结果的影响 糖添加量直接影响果酒酒精度及其品质。适宜的糖度使发酵正常进行,而糖度过高会改变细胞渗透压,引起酵母发酵异常,从而影响果酒的质量[15]。由图3可知,随着糖添加量的增加,酒精度逐渐上升,残糖含量也相应增加。当糖添加量超过210 g/L时,酒精度呈下降趋势。其原因可能是随着糖含量增大,细胞渗透压也随之增加,这极大影响了酵母菌的代谢,导致了酒精度的下降。

图3 不同糖添加量对发酵结果的影响Fig.3 The effects of different amounts ofsugar on fermentation results

2.1.4 酵母菌不同复合比对发酵结果的影响 酵母对果酒的品质和质量影响非常大,酵母性状直接影响到所酿果酒的风味与口感,决定果酒品质。采用纯种酵母酿造的果酒口味过于平淡,而复合菌种发酵会影响发酵速率和糖降解速度,同时能产生更丰富的芳香物质和风味成分[16]。由图4可知,当安琪酵母与酵母菌TP6的比例为3∶1时,发酵效果较好,酒精度最高,残糖含量较低。随着酵母菌TP6比例的增大,酒精度虽然有所下降,但酒体芳香味却在逐渐变浓,表明酵母菌TP6的产酒能力虽然较安琪酵母差一些,但产香能力却比安琪酵母强。

图4 酵母不同复合比对发酵结果的影响Fig.4 The effect of different compositeyeast on fermentation results

2.2正交实验

表2 正交实验结果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

根据正交实验结果可知,发酵条件对实验结果影响从大至小分别为糖度、温度、酵母菌复合比、SO2添加量。由方差分析可知,糖度对实验结果影响较为显著,影响较弱的是SO2添加量和酵母复合比。根据正交实验结果,复合菌发酵的野生猕猴桃果酒最佳工艺水平组合为A2B3C3D1。对最优组合进行验证,结果均较正交实验中的其它组更优,酒精度平均值可达10.6%vol,其感官评分达89,其综合分为1.094。从验证结果看,正交实验得出的最佳组合是可靠的。

采用顶空固相微萃取及气相色谱-质谱联用技术对单一菌种和复合菌种发酵的野生猕猴桃果酒中的香气成分分别进行检测,得到挥发性香气成分总离子流图,如图5、图6所示。

图5 单一菌种发酵果酒挥发性成分总离子图谱Fig.5 The total volatile components ion spectra ofsingle strain fermentation fruit wine

图6 复合菌种发酵果酒挥发性成分总离子图谱Fig.6 The total volatile components ion spectra ofmultiple strains fermentation fruit wine

通过对比总离子图谱可知,采用复合菌发酵的野生猕猴桃果酒峰数目要比采用单一菌种发酵果酒峰数目多,这说明采用复合菌发酵可以增加果酒中的风味物质。

2.4两种不同的发酵方法发酵野生猕猴桃果酒香气成分对比

安琪酵母发酵的果酒经鉴定共检测出24种挥发性成分,其中酯类物质7种、醇类物质13种,其他香气物质4种,相对含量分别占总挥发性香气物质的4.040%、95.048%、0.912%。安琪酵母与酵母菌TP6复合发酵的野生猕猴桃果酒中,共检测出35种挥发性成分,其中酯类物质11种、醇类物质13种,其他香气物质11种,相对含量分别占总挥发性香气物质的2.072%、94.310%、3.618%。

表4 不同酒样挥发性成分对比Table 4 The volatile compositioncontrast of different wine samples

通过对香气成分分析,两种果酒挥发性香气成分在种类和含量上既有共同特点,也存在差异。两种果酒中共同检出的主要香气物质为乙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇、正己酸乙酯等,在果酒中的含量比较高。相比单菌种发酵的果酒,复合菌发酵的果酒挥发性香气成分多11种。两种果酒中,醇类物质数量相同,但种类有所不同,其中乙醇含量基本持平,表明添加TP6对果酒中乙醇含量影响不大,而复合菌发酵的果酒中异丁醇、异戊醇等高级醇含量低于单菌株发酵的果酒,可能是由于TP6的加入,部分高级醇被利用,转化为其他风味物质。酯类物质中,复合菌发酵的果酒比纯菌种发酵的果酒多4种,表明添加TP6有利于果酒的增香增酯,其原因可能是在发酵过程中TP6利用部分醇类物质转化成酯,赋予果酒浓厚的酯香,促进果酒风味提升。其它挥发性物质中,复合菌发酵的野生猕猴桃果酒多7种,表明TP6的加入,丰富了果酒中物质代谢途径,从而产生更多风味成分。因此,利用复合菌进行野生猕猴桃果酒发酵生产果酒,由于微生物代谢更加活跃,物质代谢过程更加复杂,从而产生更丰富的香气成分,口感醇厚,香气浓郁。

3 结论

本研究采用安琪酵母再配以一定量的酵母菌TP6,采取复合菌进行野生猕猴桃果酒发酵,野生猕猴桃的最适发酵条件为:在发酵温度26 ℃,SO2添加量80 mg/L,糖添加量210 g/L,复合菌比例2∶1的条件下,酒精度可达10.6%vol，感官评分89，综合分为1.094。在果酒发酵过程中采用复合菌发酵,由于不同菌株在发酵过程的物质代谢过程中通过相互作用,互为补充,克服单一菌种发酵的果酒香味物质不足,口味较为平淡得缺点,复合菌发酵的果酒中构成果酒主体香气的脂类物质更丰富,其口感更加醇厚,香气浓郁,提高果酒品质。

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Effectofcomplexbacteriafermentationonwildkiwifruitwine

ZHANGJing1,ZUOYong1,*,XIEGuang-jie2,ZHANGXin1,SUNShi-guang1,QUJiao-jiao1

(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;2.Sichuan Vocational College of Chemical Technology,Luzhou 646000,China)

Fermentation conditions of kiwi fruit wine fermented by complex bacteria were mainly studied in this paper. Temperature,SO2dosage,sugar content and proportion of complex bacteria were studied to wine quality. Through orthogonal test,the optimum fermenting conditions were determined as temperature 26 ℃,SO2dosage 80 mg/L,sugar content 210 g/L,proportion of complex bacteria 2∶1. Under these conditions,alcohol content in the wine could reach up to 10.6%vol and the flavors of wine were ideal. Volatile flavor compounds of kiwi fruit wine fermented respectively by complex bacteria and angel yeast were analysed by head space solid-phase micro extraction(HS-SPME)coupled to capillary gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). As a result,35 and 24 compounds were tested in two different wine and alcohols and lipids constituted the major aroma in kiwi fruit wine.

kiwi fruit wine;complex bacteria;fermentation;flavoring compositions

TS255.1

B

1002-0306(2017)19-0213-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.039

2017-02-21

张晶(1992-)，男，硕士，主要从事发酵食品方面的研究，E-mail：451298213@qq.com。

*通讯作者:左勇(1972-)，男，硕士，教授，主要从事发酵食品方面的研究，E-mail：sgzuoyong@tom.com。

四川省科技厅产业链项目(2016FZ0034)；四川省企业技术创新项目(2015XM122)；四川理工学院研究生创新项目(Y2016011)；四川省大学生创新创业训练项目(201510622604)。