1例手足口病重症死亡病例的尸检病理观察

苏佳 李懿 徐冰 赵嘉咏 许汴利 黄学勇

(河南省疾病预防控制中心 河南 郑州 450016)

1例手足口病重症死亡病例的尸检病理观察

苏佳 李懿 徐冰 赵嘉咏 许汴利 黄学勇

(河南省疾病预防控制中心 河南 郑州 450016)

目的观察手足口病死亡病例组织器官病理变化，探讨病理发生机制，为临床诊断、治疗和预防提供科学依据。方法采集手足口病死亡病例组织、胸腔积液和粪便等标本，实时荧光RT-PCR检测胸腔积液和粪便标本中手足口病病原核酸，并进一步分离病毒，进行基因组测序和序列分析，并对组织标本进行HE染色病理学检查。结果胸腔积液和粪便标本EV71病毒核酸检测阳性，细胞培养分离到5株EV71毒株，基因型为C4基因亚型；病理组织学检查发现肺、肾脏、胸髓和肝脏组织病理变化。结论EV71病毒感染是引起手足口病患者死亡的主要原因。

手足口病；死亡；EV71病毒；尸体解剖；组织病理

手足口病是一种常见的肠道传染病，多发生于5岁以下的儿童，其主要临床表现为发热、口腔溃疡及特征性出疹等轻型病例，部分病例出现循环系统、呼吸系统、神经系统等并发症，发展为重症病例，少数病情严重者甚至导致死亡，成为危害儿童健康的重要疾患之一[1]。目前临床治疗对手足口病主要以对症治疗为主，尚无有效的抗病毒药物和疫苗接种预防控制措施，因此近年来中国许多地区疫情严重，成为长期流行趋势。手足口病是根据患者的症状和部位命名的，由20多种(型)肠道病毒引起的急性传染病，以肠道病毒7l型(EV71)和柯萨奇病毒A16(CA16)最为常见，其中EV71是引起当前我国手足口病的病原优势株[2]。EV71病毒可经消化道、呼吸道传播，传染性和毒力强，感染引起的手足口病病情进展迅速，易合并呼吸系统和中枢神经系统疾病，是重症手足口病的最主要致病病原体，对其病能力和致病机制还需进一步深入研究。本研究通过观察EV71病毒感染引起的手足口病死亡病例组织器官病理变化，探讨其病理发生机制，为临床诊疗和预防提供科学依据。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂①仪器：全自动冰冻切片机(美国Thermo Fisher公司)，显微镜(日本Olympus 公司)，荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad 公司)。②试剂：病毒RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)， 手足口病实时荧光RT-PCR试剂盒(江苏硕世生物科技有限公司)，逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。

1.2临床资料患儿，女，1岁1个月，因发热、腹胀、间断呕吐、抽泣样呼吸、精神差3 d入院治疗。病史：发热，最高40.1 ℃；右足、臀部有红色斑丘疹；精神差，易惊厥；呕吐数次，呈喷射状，呕吐物为胃内容物，并伴腹胀；抽泣样呼吸，在村诊所按发热呕吐治疗2 d，效果差。体检发现患儿面色苍白、口唇发绀，四肢末梢冰凉发绀，深昏迷；呼吸表浅不规则，30次/min，双肺呼吸音粗，可闻及湿啰音；心率130次/min，律齐，心音低钝；腹部膨隆，肝肋下4 cm可触及，脾肋下未触及，肠鸣音弱；颈强直，生理反射存在双侧巴氏征、布氏征、克氏征均阴性。临床诊断为重症手足口病、神经源性肺水肿、多脏器功能衰竭。立即器官插管、机械通气等抢救措施；脱水、降颅压、改善循环，激素冲击等支持治疗。在治疗过程中患儿突发心率减慢、呼吸心跳骤停，紧急心肺复苏、抢救无效死亡。

1.3尸体解剖与取材手足口病死亡病例按传染病尸体解剖要求进行系统的病理解剖，记录尸体各组织器官的大体形态改变，收集尸体心、 肝、 脾、 肺、 肾、脑等全部脏器和胸腔积液、粪便等标本，-80 ℃保存。

1.4标本处理和RNA提取取约2 g粪便标本于离心管中，加入10 ml磷酸盐缓冲液(PBS)，2 g玻璃珠，1 ml氯仿，充分振荡混匀。1 500 r/min，20 min离心后，取上清液140 μl，或胸腔积液140 μl，按病毒RNA提取试剂盒使用说明书进行操作提取病毒RNA。

1.5实时荧光RT-PCR方法检测反应体系为20 μl：荧光RT-PCR反应液7.5 μl，酶混合液5 μl，肠道病毒通用型反应液或CA16型/EV71型双重反应液4 μl，去RNA酶水3.5 μl，待测标本RNA 5 μl，充分混匀，6 000 r/min，离心10 s。荧光RT-PCR扩增程序：50 ℃逆转录30 min；95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火40 s，55 ℃延伸40 s，并采集荧光，45个循环；同时设立阳性、阴性对照，实验检测结束后存盘分析结果。阴阳性对照成立，Ct值≤35判为阳性。

1.6毒株分离培养与基因组测序将荧光RT-PCR检测阳性标本接种于单层人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma，RD)，置于36 ℃、5%CO2培养箱培养，连续培养7 d，每天观察并记录细胞病变，每份标本至少盲传3代。若不出现致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，则判为阴性；若出现肠道病毒特异的CPE，待CPE达到+++以上收集细胞。对收集的病变细胞样本，提取病毒RNA，使用逆转录试剂盒，合成cDNA，合成EV71全基因测序引物，RT-PCR扩增EV71基因组，扩增阳性产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.7组织病理学检查使用全自动冰冻切片机对死亡病例脏器标本冰冻切片，厚度为5～10 μm，将切片附贴在载玻片上，进行HE染色。冰冻切片60 ℃烤片2 h固定，梯度乙醇处理下行入水，入苏木素染色液中染色15 min，流水洗去染液；采用1%盐酸酒精分色，流水冲洗1～2 min以上，去除切片中的酸性物质，伊红染色5 min；常规脱水、透明、封片，显微镜观察各器官病变发生情况。

2 结果

2.1荧光定量RT-PCR检测结果采集手足口病死亡病例胸腔积液和粪便标本共5份，其中胸腔积液标本2份，盲肠、结肠、直肠内份标本各1份。分别应用手足口病实时荧光RT-PCR试剂盒进行检测，5份标本均EV71阳性。

2.2病毒分离与基因组序列同源性比较5份标本进行细胞培养和分离病毒，全部出现明显CPE，分离到5株病毒毒株。通过手足口病实时荧光RT-PCR试剂盒进一步鉴定证实为EV71毒株。对其中1株EV71进行基因组扩增测序结果显示，全基因组核苷酸长度为7 406 bp (毒株名称：EV71/HENAN/DC/2010，Accession No. HQ325852.1)，与安徽、山东、福建、北京等EV71分离株核苷酸相似性为97.5%～98.5%，基因型同属于C4基因亚型。

2.3病理组织学检查结果手足口病死亡病例心、 肝、 脾和肾器官表面光滑，与0.1～1.5岁婴幼儿正常器官相比，无明显异常；脑表面光滑，但血管轻度扩张充血；双肺表面光滑，暗红色，挤压有淡红色泡沫状液体流出。病理组织学检查结果如下。①肺：肺泡间隔明显增宽，肺泡间隔内毛细血管扩张充血出血，肺泡腔内可见少量红细胞，个别呼吸性细支气管周灶性淋巴细胞浸润。见图1。②肾脏：肾小管上皮细胞中度水样变性，管腔内可见粉染浆液性渗出，肾小球充血，肾间质内大量血管扩张充血出血，尤其以髓质改变显著。见图2。③胸髓：蛛网膜下腔管周围毛细血管扩张，血管周较多淋巴细胞浸润，神经胶质内血管周水肿。见图3。④肝脏：肝小叶结构正常，小叶内肝细胞索萎缩，肝窦扩增，个别肝细胞脂肪变性，门管区少量淋巴细胞浸润。见图4。

图1 肺泡间隔内毛细血管扩张充血出血(×100)

图2 肾间质内大量血管扩张充血出血(×100)

图3 蛛网膜下腔管周围毛细血管扩张， 其周围有较多淋巴细胞浸润(×100)

图4 肝小叶结构正常，门管区少量淋巴细胞浸润(×50)

3 讨论

手足口病是多种肠道病毒引起的，主要病原体包括柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5型；埃可病毒和EV71，其中以EV71及CA16型最为常见[3-4]。近年来，中国手足口病报告病例数逐年增加，实验室诊断病例中， EV71所占比例超过50%，该病病程短，进展快，易发展为重症病例，少数病例出现死亡，其中超过90%的手足口病死亡病例由EV71感染导致[5-6]。本研究中，从手足口病死亡病例胸腔积液和粪便标本中检测EV71阳性，证实该病例死亡是由EV71感染引起的，并进一步分离到毒株，基因组核苷酸比对分析，与近年来我国EV71分离株相似性为97.5%～98.5%，没有发生较大变异。通过尸体解剖和病理学检查可发现患儿肺、肾脏、胸髓和肝脏等器官出现病变，说明EV71对这些组织具有严重侵害作用，可导致病毒性肺炎、病毒性脑炎和免疫器官损害，甚至死亡。这与蒙国照等[7]研究结果相类似。

综上所述，EV71病毒感染是引起手足口病患者死亡的主要原因，临床应针对EV71病毒探索有效诊疗与预防该病的突破点，对提高其临床预后有重大意义。

[1] 马红霞,潘静静,李懿,等.合并神经症状的手足口病病原学和流行病学特征[J].中华微生物学和免疫学杂志,2016,36(11):851-854.

[2] 郑亚明,杨娟,廖巧红.中国6月龄至5岁以下手足口病重症病例直接医疗费用情况及其影响因素[J].中华预防医学杂志,2017,51(1):87-92.

[3] Yan J J, Su I J, Chen P F,et al. Complete genome analysis of enterovirus 71 isolated from an outbreak in Taiwan and rapid identification of enterovirus 71 and coxsackievirus A16 by RT-PCR[J].J Med Virol,2001,65(2):331-339.

[4] Pérez-Vélez C M, Anderson M S, Robinson C C, et al. Outbreak of neurologic enterovirus type 71 disease: a diagnostic challenge[J].Clin Infect Dis,2007,45(8):950-957.

[5] 黄学勇,康锴,许玉玲,等.2008—2011年河南省手足口病患儿病原学监测结果[J].中华预防医学杂志,2012,46(10):883-887.

[6] 隋吉林,王子军.635例手足口病死亡病例流行病学及临床特征分析[J].中华流行病学杂志,2012,33(11):1201-1202.

[7] 蒙国照,李美琼,李运千,等.危重型手足口病3例尸检临床病理分析[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(1):48-51,55.

Postmortempathologyobservationonadeathcaseofseverehandfootandmouthdisease

Su Jia, Li Yi, Xu Bin, Zhao Jiayong, Xu Bianli, Huang Xueyong

(HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

ObjectiveTo explore the pathogenesis of hand foot and mouth disease by observing the pathological changes of tissues and organs of the death case of severe hand foot and mouth disease, so as to provide scientific basis for clinical diagnosis, treatment and prevention.MethodsTissue, pleural effusion and stool samples of the death case of severe hand foot and mouth disease were collected, and pathogenic nucleic acid was detected using real-time RT-PCR,followed by isolation of the virus, genome sequencing and sequence analysis, HE staining, pathological examination.ResultsEV71 virus nucleic acid in pleural effusion and stool samples was positive, and 5 strains of were isolated by cell culture, and the genotype was C4. The pathological changes of lung, kidney, thoracic spinal cord and liver were observed by histopathological examination.ConclusionEV71 infection is the leading cause of death in patients with hand foot and mouth disease.

hand foot and mouth disease; death; EV71 virus; autopsy; histopathology

R 361+.2

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.19.003

2016-12-25)

河南省科技创新杰出青年人才项目(164100510008)；河南省科技攻关计划项目 (122102310268)；河南省医学科技攻关计划省部共建项目(201001015)。

黄学勇，E-mail：hxyzzu@163.com。