电针对膝关节骨性关节炎大鼠关节液中IL-1β、MMP-13和S100A12蛋白表达的影响*

李洪涛，刘 昊，杨方军，李艳秋，孙晓伟,△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

电针对膝关节骨性关节炎大鼠关节液中IL-1β、MMP-13和S100A12蛋白表达的影响*

李洪涛1，2，刘 昊1，杨方军3，李艳秋2，孙晓伟1,2△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的:观察电针对膝骨性关节炎大鼠关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表达的影响。方法:30只SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组和电针组，注射4%木瓜蛋白酶复制大鼠膝关节骨性关节炎模型，分别于造模成功后5周、7周，采用酶联免疫吸附法检测大鼠关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量的变化。结果：模型组和电针组大鼠不同时间点膝关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量均较空白组明显升高(P<0.05)；但电针组大鼠IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量较同时间点模型组明显降低(P<0.05)。且电针组大鼠造模成功后7周，膝关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量较5周时有所降低，具有统计学差异(P<0.05)；而模型组大鼠两个时间点比较无统计学意义(P>0.05)。结论：电针可能通过下调IL-1β、MMP-13和S100A12蛋白的表达，抑制炎性因子的释放、阻止软骨基质的降解、调控机体的免疫应答，进而保护受损的关节软骨，促进关节软骨的结构和功能的恢复。

膝关节骨性关节炎；电针；IL-1β；MMP-13；S100A12

膝关节骨性关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是一种临床常见病、多发病，是一种进行性和缓慢性侵犯负重关节的退行性膝骨关节疾病[1-2]。白介素-1β(IL-1β)是一种细胞因子，白细胞介素的一种，由活化的巨噬细胞所产生，主要参与免疫反应的细胞增殖、分化，在炎症反应中起重要作用。基质金属蛋白酶-13(MMP-13)，是基质金属蛋白酶家族成员之一，由软骨细胞产生，主要降解细胞外基质Ⅱ型胶原，参与软骨破坏。促炎因子S100A12是近年来新发现的一种钙结合蛋白，与机体的炎症反应和免疫防御密切相关。有研究表明，IL-1β、MMP-13细胞因子能导致软骨的降解[3]，在软骨病理变化中起到重要作用[4]。而S100A12可通过增强细胞外基质蛋白水解及自身免疫，参与骨性关节炎疾病的活动和关节软骨的破坏[5]。三者在KOA 的病理过程中均起着重要的作用。

笔者前期的临床研究与动物实验发现[6-7]：电针治疗膝骨性关节炎疗效确切，能明显缓解膝骨性关节炎患者疼痛、僵硬程度，提高其日常生活能力；电针亦能明显改善膝骨性关节炎大鼠关节软骨的损伤程度。因此，本研究拟通过动物实验，观察电针对膝骨性关节炎大鼠关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表达的影响，探讨电针治疗膝骨性关节炎的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

将30只SPF级雄性SD大鼠[黑龙江中医药大学实验动物中心提供,SCXK(黑)20100027]，体质量(300±20)g,随机分为空白组、模型组和电针组；每组又分为造模成功后5周和7周两个亚组(n=5)。

1.2 仪器及试剂

酶联检测试剂盒：IL-1β(Diaclone，670.040.096)、MMP-13(Mybiosource，MBS702112)、S100A12(Mybiosource，MBS731072)。电针治疗仪(SDZ-Ⅱ型，苏州医疗用品厂有限公司)。

1.3 造模及模型成功标准

KOA大鼠模型的制备参照Pomonis JD[8]方法，分别于1天、4天、7天在大鼠膝关节腔内注射0.2 ml 4%木瓜蛋白酶水溶液。模型成功标准：采用Lequesne MG评分[9]于木瓜蛋白酶水溶液注射后2周，评估大鼠的膝关节情况，大于4分者表明模型制备成功。

1.4 干预方法

电针组：大鼠取穴：参照华兴邦《大鼠穴位图谱》[10]，局部取患侧的犊鼻、内膝眼、曲泉，远端取患侧的太溪。操作[6]：模型复制成功后，每天固定时间给予大鼠电针干预，取穴太溪穴、曲泉穴(接一组电针，同侧相连，正极在上，负极在下)，内外膝眼(接一组电针)，疏密波刺激(H1为3 Hz，H2为100 Hz,电压为2 V),以下肢肌肉收缩引起肢体或针柄轻微颤动为宜，每日1次，留针30 min。

空白组和模型组：每天同时间点给予同电针组一致的固定束缚30 min。

1.5 IL-1β、MMP-13、S100A12酶联测定

各组时间点干预结束后，抽取适量关节液，静置1 h，7500转/min，离心8 min，取上清液，按照酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒说明书进行IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量的检测。

1.6 统计学方法

所有数据采用SPSS19.0 统计软件进行分析，计量数据以均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析，多重比较用LSD或者SNK法，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠膝关节液中IL-1β蛋白表达结果

空白组大鼠膝关节液中IL-1β蛋白含量较低，且造模成功后5周和7周IL-1β蛋白表达无明显差异(P>0.05)。模型组和电针组大鼠不同时间点膝关节液中IL-1β蛋白含量均较空白组明显升高，有统计学意义(P<0.05)；但电针组大鼠IL-1β蛋白含量较同时间点模型组明显降低(P<0.05)。组内比较：电针组大鼠造模成功后7周，膝关节液中IL-1β蛋白含量较5周时有所降低，具有统计学差异(P<0.05)；而模型组大鼠两个时间点比较无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠膝关节液中IL-1β表达比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，★P<0.05;与造模成功后5周比较，☆P<0.05

2.2 各组大鼠膝关节液中MMP-13蛋白表达结果

空白组大鼠膝关节液中MMP-13蛋白含量较低，且造模成功后5周和7周MMP-13蛋白表达无明显差异(P>0.05)。模型组和电针组大鼠不同时间点膝关节液中MMP-13蛋白含量均较空白组明显升高，有统计学意义(P<0.05)；但电针组大鼠MMP-13蛋白含量较同时间点模型组明显降低(P<0.05)。组内比较：电针组大鼠造模成功后7周，膝关节液中MMP-13蛋白含量较5周时有所降低，具有统计学差异(P<0.05)；而模型组大鼠两个时间点比较无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠膝关节液中MMP-13表达比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，★P<0.05;与造模成功后5周比较，☆P<0.05

2.3 各组大鼠膝关节液中S100A12蛋白表达结果

空白组大鼠膝关节液中S100A12蛋白含量较低，且造模成功后5周和7周S100A12蛋白表达无明显差异(P>0.05)。模型组和电针组大鼠不同时间点膝关节液中S100A12蛋白含量均较空白组明显升高，有统计学意义(P<0.05)；但电针组大鼠S100A12蛋白含量较同时间点模型组明显降低(P<0.05)。组内比较：电针组大鼠造模成功后7周，膝关节液中S100A12蛋白含量较5周时有所降低，具有统计学差异(P<0.05)；而模型组大鼠两个时间点比较无明显差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠膝关节液中S100A12表达比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，★P<0.05;与造模成功后5周比较，☆P<0.05

3 讨论

KOA是由于力学和生物学因素共同导致的膝关节结构改变或膝关节软骨破坏，从而出现膝关节功能障碍的一种慢性退行性疾病。IL-1β、MMP-13、S100A12是诱导膝骨性关节炎病理过程中软骨基质降解和破坏的重要因子[11]。IL-1β细胞因子可促进软骨细胞和滑膜分泌NO、前列腺素E2，产生基质金属蛋白酶(MMPs)，从而诱导关节软骨细胞凋亡,加重炎症反应,加速软骨基质的降解[11]。同时IL-1β能够抑制软骨蛋白聚糖合成，从而降低II、IX 型胶原蛋白的复合，导致软骨细胞代谢失衡和变形，引起软骨退变。在膝关节炎症刺激的作用下，软骨细胞可分泌大量的基质金属蛋白酶，破坏了MMP-TIMP的动态平衡。而MMP13是MMPs家族中对裂解Ⅱ型胶原活性最强，Ⅱ型胶原又是组成软骨细胞外基质的最主要成分，MMP13参与了细胞软骨的破坏，因此，MMP13表达水平与KOA患者症状、病程、软骨破坏程度均呈正相关性[12]。另外，MMP13升高，导致胶原网受到破坏，亦使得软骨细胞更容易受到炎症因子的攻击，形成恶性循环[13]。S100A12是新近发现的一种钙结合蛋白，参与炎性细胞的激活、化学趋化和伤口的愈合等，是炎症性疾病活动高度敏感的生物标志物[14]。有研究表明，S100A12的高表达可能通过增强细胞外基质蛋白水解及自身免疫，参与骨性关节炎疾病的活动和关节软骨的破坏[5]。代凤雷等[15]研究发现，血液及关节外组织中分泌的S100A12进入血液循环后，到达KOA患者的关节周围组织如滑膜，则可促进滑膜炎的产生；并且患者骨关节炎严重程度与S100A12 的表达水平成正相关。

本实验通过酶联免疫吸附法检测大鼠膝关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表达，发现空白组大鼠膝关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量较低，而木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎模型中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表达较空白组明显上升。电针干预后，不同时间点膝关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量均较同时间点模型组明显降低(P<0.05)；且随着针刺次数的增加和治疗时间的延长，造模成功后7周，膝关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白含量较5周时有所降低，具有统计学差异(P<0.05)，但仍高于空白组；而模型组大鼠两个时间点比较无明显差异(P>0.05)。笔者前期研究已证实[6]，电针能明显降低关节软骨的损伤程度，能够起到保护关节软骨的作用。而本研究结果表明，电针治疗可以明显降低KOA大鼠关节液中IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白的表达，因此，笔者推测电针治疗膝关节骨性关节炎，可能与其下调IL-1β、MMP-13、S100A12蛋白表达有关，从而抑制膝关节骨性关节炎大鼠炎性因子的释放、阻止软骨基质的降解、调控机体的免疫应答，进而保护受损的关节软骨、促进关节软骨的结构和功能的恢复。

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ExpressionofIL-1β、MMP-13andS100A12ProteininJointFluidsofKneeOsteoarthritisRatsInfluencedbyElectro-acupuncture

LI Hong-tao1,2, LIU Hao1, YANG Fang-jun3, LI Yan-qiu2, SUN Xiao-wei1,2△

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective：To observe the effect of electro-acupuncture on IL-1β、MMP-13 and S100A12 protein expression in joint fluids of knee osteoarthritis rats.Methods30 SD rats were randomly divided into the blank group, the model group and the electro-acupuncture group. The models were established by injecting 4% papain. IL-1β、MMP-13 and S100A12 protein content in joint fluid were tested wtih Elisa method five weeks and seven weeks respectively after the establishment of successful models.ResultsThe levels of IL-1β, MMP-13, S100A12 protein content in the model group and electro-acupuncture group were significantly higher than those of the blank group at both time points(P<0.05); but those levels were significantly lower than those of the model group at the same time point(P<0.05); moreover, those levels of seven weeks after were lower than those of five weeks after, and the difference was statistically significant(P<0.05); however, there was no statistical significance between the seven weeks after and five weeks after in the model group(P>0.05).ConclusionElectro-acupuncture may promote the recovery of the structure and function of arthrodial cartilage by down-regulating the expression of IL-1β, MMP-13 and S100A12 protein, inhibiting the release of inflammatory factors, preventing the degradation of cartilage matrix, regulating the immune response of the organism.

Knee osteoarthritis; Electro-acupuncture; IL-1β; MMP-13; S100A12

R246.2

A

1005-0779(2017)09-0057-03

黑龙江省科学基金项目,编号：H2017058;黑龙江省博士后资助项目,编号：LHB-Z12265。

李洪涛(1979-)，男，副主任医师，硕士研究生导师，黑龙江中医药大学在站博士后研究人员,研究方向：中西医结合治疗骨与关节疾病的临床与机理研究。

△通讯作者：孙晓伟(1979-)，女，副主任医师，硕士研究生导师，黑龙江中医药大学在站博士后研究人员,研究方向：针灸治疗神经系统疾病的临床与机理研究。

2017-03-04