液相色谱–同位素稀释质谱法测定人体生长激素＊

金有训，石莲花，武利庆，王晶

（中国计量科学研究院，北京 100013）

液相色谱–同位素稀释质谱法测定人体生长激素＊

金有训，石莲花，武利庆，王晶

（中国计量科学研究院，北京 100013）

建立了准确、快速测定痕量人体生长激素的同位素稀释质谱法。选取同位素标记脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸为内标物，将内标物以重量法与待测样品准确混合，利用Kinetex C18色谱柱分离，以电喷雾三重串联四级杆质谱多反应监测模式测定，建立了人体生长激素的液相色谱–同位素稀释质谱联用定量方法。人体生长激素溶液标准物质的含量测定结果为(1.82±0.04) mg/g，相对标准偏差为0.43%（n=6）。该方法简易、实用、准确、可靠，可作为人体生长激素溶液标准物质的定值方法，并为人体生长激素的日常检测提供参考。

人体生长激素溶液标准物质；液相色谱法；同位素稀释质谱法；定量

人体生长激素（hGH）是人体自身分泌的、可促进生长发育的重要肽类激素，由191种氨基酸组成，临床应用于生长激素缺乏的儿童矮小症、先天性卵巢发育不全综合症、急性坏死性胰腺炎、烧伤、脓毒症等病症的治疗［1–3］。早期hGH只能从尸体脑垂体中提取［4］，来源困难，价格昂贵，难以广泛应用。近年来随着基因重组技术的快速发展，人们开始以重组技术生产hGH，hGH在临床上的应用逐渐扩展，但出现了使用不当或过量使用引起严重不良反应的情况。2008年世界反兴奋剂机构宣布了一系列运动员禁用的药物，其中就有 hGH［5–6］，因此 hGH 的准确定量受到世界越来越多的关注。hGH检测使用的试剂种类多，来源多，特别是相应的标准物质缺乏，造成检测结果偏差较大，亟需建立高准确度、高精密度的hGH测量方法。

目前，hGH的临床检验方法有免疫分析法［7–8］、液相色谱(HPLC)法［9］、液相色谱–串联质谱法(LC–MS/MS)法［10–12］、毛细管电泳结合紫外和质谱技术［13］。以上方法都是hGH相对测定法，操作复杂，耗时较长，而且缺乏hGH标准物质。近年来，国外一些技术机构研制了hGH相关标准物质，如韩国标准科学研究院(KRISS)的hGH溶液标准物质、德国联邦物理技术研究院(PTB)的人血清基质hGH标准物质，而我国hGH相关标准物质尚为空白。

笔者采用国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM）认可的同位素稀释技术［14–15］，结合液相色谱–串联质谱技术，建立hGH纯品蛋白质含量绝对测量的LC–IDMS/MS法，并对其测量结果进行不确定度评定。此项研究在建立我国hGH量值溯源传递体系，保证临床检验中hGH测定结果的准确性、可比性等方面具有重要的意义，也可为建立相应标准提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱–质谱联用仪：Agilent1200/API5500型，美国安捷伦科技有限公司/美国AB公司；

分析天平：ME235S型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯集团；

混合器：VORTEX GENIE 2型，美国Scientific Industries公司；

移液 器：10～100 μL，20～200 μL，100～1 000 μL，0.5～5 mL，德国 Eppendorf公司；

氮吹仪：N–EVAP112型，美国OA–SYS公司；

离心机：RC10–22T型，美国Thermo公司；

过滤膜：0.22 µm，亲水性聚丙烯膜，美国Pall公司；

氨基酸纯度标准物质：(1)脯氨酸，编号为GBW(E) 100084，纯度为99.5%，(2)缬氨酸，编号为GBW(E) 100055，纯度为99.3%，(3)苯丙氨酸，编号为GBW(E) 100061，纯度为99.9%，中国计量科学研究院；

氨基酸同位素标记物：(1)13C5-脯氨酸，纯度为99%，(2)13C5-缬氨酸，纯度为99%，(3)13C9-苯丙氨酸，纯度为98%，美国剑桥同位素实验室；

hGH样品：每瓶1 mL，于–70℃冰箱中保存，韩国标准科学研究院（KRISS）；

三氟乙酸：色谱纯，北京迪科马科技有限公司；

盐酸：优级纯，北京化学试剂公司；

乙腈：色谱纯，美国J. T. Baker公司；

甲酸：色谱纯，美国Sigma公司；

实验用水为超纯水，由美国Mililpore公司超纯水仪制得。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱

色 谱 柱：Kinetex C18柱 (150 mm×2 mm，2.6µm，美国菲罗门公司)；柱温：40℃；进样体积：3µL；流量：0.2 mL/min；分析时间：5 min。

1.2.2 质谱

采用电喷雾离子源(ESI)、正离子多反应监测(MRM)模式；喷雾电压：5.0 kV；壳气压力：2 MPa；辅助气压力：0.5 MPa；干燥气温度：550℃；碰撞能量：25 eV；监测离子：脯氨酸为m/z116→70，13C5-脯氨酸为m/z121→74，缬氨酸为m/z118→72，13C5-缬氨酸为m/z123→76，苯丙氨酸为m/z166→120，13C9-苯丙氨酸为m/z175→128。

1.3 实验步骤

1.3.1 样品准备

hGH样品共6支，每支约装有1 mL hGH，保存于–70℃冰箱中，测定时每支样品取1 mL，进行前处理。

1.3.2 标准溶液及样品前处理

分别准确称取一定量缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸标准物质，各用1%甲酸水溶液稀释并配制成1 mg/mL的标准储备液，用混合器漩涡10 min，充分溶解。再各取一定量标准储备液，用1%甲酸水溶液稀释至10倍体积，制得缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸标准工作溶液。同样步骤制备13C5-缬氨酸、13C5-脯氨酸、13C9-苯丙氨酸的标准储备液及标准工作溶液。

使用各氨基酸及同位素标记物的标准工作溶液，配制与样品中各待测氨基酸含量接近（约1∶1）的同位素标记与非标记氨基酸混合标准溶液，经0.22 µm滤膜过滤后进行液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）分析。

精确称取1 mg hGH，溶于1 mL纯水，配制成1 mg/mL hGH标准溶液，用0.45 µm滤膜过滤，取50µL 滤液于2 mL安瓿瓶中，加入同位素标记氨基酸混合标准溶液，使氨基酸与相应同位素标记的氨基酸质量比接近于1∶1。充分混合后，真空离心干燥30 min，加入 6 mol/L 盐酸 500 µL，通氮除氧后密封，于110℃烘箱中进行水解。水解后用氮气吹干，用500 µL 0.1%盐酸溶液复溶，溶液经0.22 µm滤膜过滤后进行LC–MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 hGH纯品蛋白质酸水解

目前，hGH尚无相应的蛋白质同位素标记物，因此利用蛋白质的酸水解方法使hGH获得游离氨基酸，基于氨基酸结合同位素稀释质谱法对hGH蛋白质进行定量。盐酸是蛋白质水解的常用酸，蛋白质水解受温度、盐酸的浓度、水解时间等影响，是蛋白质定量中的关键步骤。为了使hGH完全水解成游离氨基酸，分别于110℃高温下水解12，24，48，72，96 h，并选择在酸性条件下相对稳定的脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸作为待测氨基酸，确定最佳的水解时间。结果表明，水解48 h后，3种氨基酸的相对比例都达到较稳定的平台期［16］。

2.2 hGH纯品蛋白质在LC–IDMS上的分离

氨基酸标准品和hGH纯品蛋白质水解样品在液相色谱–同位素稀释串联质谱上的分离情况如图1所示。图1(a)为3种氨基酸标准物质的LC–MS/MS分离色谱图，图1(b)为hGH纯品蛋白质检测样品的LC–MS/MS分离色谱图。从图中可以看出5 min之内可以快速分离3种氨基酸，脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸的保留时间分别为1.61，1.93和3.68 min。在hGH纯品蛋白质样品的色谱图中还检测出异亮氨酸和亮氨酸，其分离度和测量重复性良好。美国国家标准与技术研究院（NIST）检测5种氨基酸需要25 min［17］，而此方法在5 min内实现快速分离，节约了分析时间。

图1 氨基酸多反应检测模式色谱图

2.3 结果计算

用同位素稀释单点校准法计算样品中氨基酸的含量，计算公式为式(1)：

式中：C——样品中氨基酸的含量，mg/g；

Cstd——标准溶液中氨基酸的含量，mg/g；

Mstd——标准溶液中氨基酸的质量，mg；

Isample——样品溶液中氨基酸与同位素标记物的色谱峰面积比值；

Mis-spiked——样品溶液中加入同位素标记物的质量，mg；

Mis-std——标准溶液中加入同位素标记物的质量，mg；

Istd——标准溶液中氨基酸与同位素标记物的色谱峰面积比；

Wsample——样品质量，mg。

根据计算所得氨基酸的含量，转换后得出hGH蛋白质的浓度。

2.4 hGH纯品蛋白质的定量结果

利用IDMS方法测定氨基酸含量，然后间接确定hGH蛋白质的含量。使用单点法测定，从样品中分别取6份子样进行同位素稀释质谱法测定，每进一次标准样品，再进一次样品，每瓶水解样品测定3次，hGH蛋白质含量的定量结果列于表1。

表1 LC–IDMS法对hGH蛋白质的测定结果

由表1可知，LC–IDMS法的重复性好，hGH蛋白质浓度的相对标准偏差为0.43%。利用同位素稀释质谱法测定hGH蛋白质含量，测定结果在KRISS hGH标准物质定值结果［(1.76±0.25) mg/g］不确定度范围内，表明利用本方法测定高丰度、高稳定性的氨基酸，从而对蛋白质进行间接定量，精密度、再现性良好。

3 结语

建立了hGH纯度的LC–IDMS测定方法。所建立的LC–IDMS方法溯源清晰，准确度高，可作为hGH溶液标准物质的定值技术，为hGH相关基质蛋白及其它基体蛋白的定量提供新的思路和手段。并可用于其它内分泌肽类和蛋白类激素的准确定量，为疾病诊断标志物肽类和蛋白质含量的准确定量方法研究和标准物质的研制奠定基础。

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我国环保监测行业发展趋势及前景预测分析

环境监测是整个环保行业的基础。如果没有监测，就没有办法对水、气、土进行检测，无法评估环境防治效果以及监督污染源的整治。同时，国家如果想更好地掌握环境信息，就必须依靠自己所建设的环境监测网，为此国家重点打造自身的环境监测网络。“十二五”期间国控监测网体系已经基本搭建完成，“十三五”的主要任务是进一步完善整个监测网体系，并且逐步向省市一级的监测网下沉。长远来看，监测网体系将会遍布行业各个环节。

环境监测分环境质量监测和污染源监测。环境质量监测主要是考核环境保护成果以及环境质量，监测对象有大气、水、土壤和噪声监测。污染源监测主要是控制有害物质的排放量，监测对象有废污水、废气以及重金属。

环境质量监测中，大气监测主要由国控点(以地级以上行政单位为主)开始逐渐下沉到省控点(以县级行政单位为主)以及农村空气监测。水质监测分地表水监测和地下水监测：其中地表水监测包括各大江河湖海、集中式水源地、近海海域等。主要由国家地表水质监测断面为主。地下水污染监测体系需要结合之前国土资源、水利工程等已有的地下水工程。土壤监测方式主要为土壤采样、实验室分析为主，环保部印发多篇文件规范土壤监测方法与技术。污染源监测中，废(污)水主要来自于生活污水和工业污水排放。废气监测以前主要是CEMS系统监测，后来增加了针对有机污染物的VOCs监测。主要来自工业废气排放企业的监测和布点。重金属的排放主要通过工业废水废气废渣的方法排放，因此重金属监测和现有的工业废(污)水、废气监测是紧密联系的。

“十二五”以及“十三五”期间，各项国家政策推动监测行业快速发展。但是在整个环保行业中，监测行业中监测的市场体量依旧比较小，还具有很大的发展空间。根据国家环境监测总站的数据，监测行业销售额从2011年的108亿上升到了2015年227亿，年复合增长率约16%。

目前全国从事环境监测业务的企业共有约200家，大部分企业从事废气、废水、环境空气、地表水等在线自动监测系统的研制、生产、安装、运营(含集成商)。其中，约有120家企业生产废气在线监测系统，约有80家企业生产废水在线监测系统。

截至2015年底，共建成全国环境空气质量监测点3 360个，其中“国控点”1 436个。根据《全国农村环境质量监测工作实施方案》，2017～2019年新增1 695个村庄的环境监测站，2020年之后新增5 000余个村庄的环境监测工作站。

（中国分析计量网）

Quantification of Human Growth Hormone by Liquid Chromatography–Isotope Dilution Mass Spectrometry

Jin Youxun, Shi Lianhua, Wu Liqing, Wang Jing
(National Institute of Metrology, Beijing 100013, China)

The method for determining human growth hormone (hGH) by liquid chromatography–isotope dilution mass spectrometry (LC–IDMS) was developed. The isotope labeled proline, valine and phenylalanine were added into the hGH samples as internal standard. The samples were separated by Kinetex C18column, and detected by tandem mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source used in multiple reaction monitoring mode(MRM). The content of hGH was (1.82±0.04) mg/g with RSD of 0.43% (n=6). The developed method is simple, practical, accurate,reliable, and reproducible, it is able to be applied for the development of pure hGH certified reference material (CRM) and to provide reference for the routine detection of hGH.

certified reference material of human growth hormone solution; liquid chromatography; isotope dilution mass spectrometry; quantitation

O657.7

A

1008–6145(2017)05–0012–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.003

*技改量传项目(32-ALC1518-JY)；国家重点研发计划项目(2016YFD0500800)

联系人：金有训；E-mail: jinyx@nim.ac.cn

2017–06–08