亚甲基蓝对黄颡鱼鱼卵高卵壳裂解酶(HCE)表达的影响

李浩然，董亚萍，杨 柳，胡 鲲，杨先乐

(1.国家水生动物病原库；水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心；水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海 201306；2.上海长峰房地产开发有限公司，上海 200042)

亚甲基蓝对黄颡鱼鱼卵高卵壳裂解酶(HCE)表达的影响

李浩然1,2，董亚萍1，杨 柳1，胡 鲲1，杨先乐1

(1.国家水生动物病原库；水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心；水产科学国家级
实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海 201306；2.上海长峰房地产开发有限公司，上海 200042)

鱼卵高卵壳裂解酶(HCE)是鱼类孵化酶中的一种，在水生生物胚胎发育过程中起非常重要的作用，其表达可能会受到化学药物的影响。以黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)受精卵为研究对象，采用免疫组织化学方法研究了亚甲基蓝对黄颡鱼鱼卵高卵壳裂解酶表达的影响。以15 mg/L亚甲基蓝浸泡黄颡鱼受精卵，同时设置不做任何药物处理的空白对照组，分别在受精后0、1、2、4、8、12、24 h取黄颡鱼受精卵或胚胎，4%多聚甲醛固定，石蜡切片，免疫组织化学方法染色，倒置显微镜观察，Image-Pro Plus6.0软件分析每张照片的累积光密度值。结果表明，亚甲基蓝实验组与空白对照组中均有HCE表达，但是亚甲基蓝实验组中HCE的相对表达量显著高于其相应的空白对照组。不同受精时间的对照组和实验组之间HCE的相对表达量无统计学差异。亚甲基蓝明显促进HCE的分泌，可能与鱼卵的代偿或应激反应有关，由此推测亚甲基蓝对胚胎有一定的毒性。

亚甲基蓝；黄颡鱼胚胎；鱼卵高卵壳裂解酶；免疫组织化学

Abstract：High choriolytic enzyme(HCE) plays an important role during the fish artificial propagation,which could be affected by chemical drugs.In this study,the embryo ofPelteobagrusfulvidracowas chosen to measure the effect of methylene blue on expressions of HCE by using immunohistochemical method.The zygotes ofP.fulvidracowas steeped with 15 mg/L methylene blue,meanwhile the blank control group was steeped with no drug conduct.The zygotes or embryos ofP.fulvidracowhich have fertilized 0 h,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h were selected,immobilized by 4% paraformaldehyde and make paraffin section.Each section was observed under the microscope after immunohistochemical staining.The integral optical density(IOD) of each photograph was analyzed by Image-Pro Plus6.0 software.The results revealed that hatching enzyme distributed both in methylene blue experimental group and blank control group.However,the relative expression of HCE in methylene blue experimental group was significantly higher than the blank control group.There was no statistics difference between the relative expression of HCE in blank control group and experimental group.The results of showed that methylene blue could significantly promote the secretion of HCE.It may be associated with the compensatory or stress response of fish embryos.So we can infer that methylene blue has toxicity to embryos.

Keywords： methylene blue;embryos ofPelteobagrusfulvidraco;high choriolytic enzyme;immunohistochemisty

孵化酶(hatching enzyme)具有特异性降解卵膜的功能，广泛存在于家蚕[1]、海胆[2]、对虾[3]、鱼类[4,5]等动物的胚胎中。鱼类的孵化酶因具有特异性降解卵壳的特性而被广泛研究，旨在用于鱼类基因转移、核移植等相关遗传工程[6]，由高卵壳裂解酶(High Choriolytic Enzyme,HCE)和低卵壳裂解酶(Low Choriolytic Enzyme,LCE)两种成分组成，是由鱼类的孵化腺细胞分泌而来，其中HCE先于LCE被分泌出来[7]。在HCE和LCE的共同作用下使鱼类胚胎的卵膜被降解[8]。黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)隶属于鲶形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae)黄颡鱼属(Pelteobagrus),广泛分布于长江、黄河、珠江、沅江及黑龙江等各水域[9-11]。是一种常见的中小型经济鱼类,具有肉质细嫩、肉味鲜美、营养丰富、无肌间刺等优点,颇受广大消费者欢迎,市场价格一度攀升[11]。然而黄颡鱼在人工繁殖过程中水霉病频发，给养殖户带来了难以估量的经济损失。亚甲基蓝又名碱性湖蓝、次甲基蓝、美蓝等，呈深绿色有光泽的颗粒状或粉状结晶，具碱性，其水溶液呈蓝色，是一种常见的工业染料，也是印染业废水中的主要成分之一。近年来，在孔雀石绿被禁用后，亚甲基蓝常被用于防治鱼卵水霉病[12]。但是有研究发现亚甲基蓝及代谢物有致畸、致突变作用，在日本、美国等国并未允许其用于水产养殖[13，14]。虽然我国尚未将亚甲基蓝列为禁用药物，但是其对于鱼类潜在的安全性威胁亟待研究。本实验从HCE的角度入手，采用免疫组织化学方法评价了亚甲基蓝对高卵壳裂解酶在蛋白水平相对表达量的影响，为评估亚甲基蓝在鱼卵孵化过程中的潜在风险提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄颡鱼受精卵由湖南省岳阳市华容县田家湖渔业科技有限公司惠赠，受精后立即用黄泥脱粘放入孵化桶中，室内恒温流水孵化，孵化温度(25±0.5) ℃，pH 7.4左右。

1.2 主要试剂

EDTA 抗原修复液、PBS缓冲液(0.01 mol/L)、Harris苏木素染液购自广州晶泉生物有限公司，BSA购自Sigma公司。鱼卵高卵壳裂解酶一抗由上海佑隆生物科技有限公司制备，免疫组化试剂盒DAB(二氨基联苯胺，3，3′-diaminobenzidine)显色剂、羊抗兔二抗购自DAKO公司。

1.2.1 鱼卵高卵壳裂解酶(HCE)一抗制备方法

根据日本青鳉(Oryziaslatipes)(在蛋白质序列上，硬骨鱼以日本青鳉为代表)HCE蛋白质序列(序列号：NP_001098293.1)设计2条多肽链作为免疫原，分别为LLEGDLVAPTNRNA(14)和TPYDYSSIMHYGRD(14)，多肽链由上海佑隆生物科技有限公司合成；将偶联后的多肽-BSA与等体积的福氏佐剂混合乳化均匀成油包水状态后分别皮下注射到2只新西兰大白兔，免疫3次后，取血清经ELISA检测，抗血清效价不低于1∶50 000；(这里的1∶50 000是最后一次免疫后血清的效价，并非做实验(WB等)的效价)将收集到的抗血清经硫酸铵纯化，得到高卵壳裂解酶(HCE)兔多克隆抗体。

1.3 实验方法

1.3.1 鱼卵处理

参考亚甲基蓝防治鱼卵水霉病的用法与用量，将受精后的黄颡鱼卵立即放入15 mg/L亚甲基蓝中浸泡30 min，清洗数次，无损伤转移至清水中。同时设不做任何处理的空白对照组，试验组和空白对照组均使用500枚鱼卵。孵化条件同1.1。

1.3.2 鱼卵采集与组织切片

分别在受精后0、1、2、4、8、12、24 h取实验组及空白对照组未被水霉感染的健康黄颡鱼受精卵或胚胎各50枚，用PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4)稍稍清洗并吸干水分后，迅速将鱼卵放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h后75%酒精保存。将固定好的鱼卵经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为5 μm。将包含有组织的蜡块粘附于APES粘片剂处理的载玻片上，放在40 ℃烘箱中烘干2 h后，放在玻片盒中备用。

1.3.3 免疫组织化学染色

将1.3.2中烘干后的切片脱蜡，修复抗原，脱色，加入一抗(阴性对照组不加入一抗)，脱色后加入二抗，滴加显色液，复染，脱水，透明，封片。完成免疫组织化学染色[15]。

审计作为我国现代化建设中很重要的一部分，对于构建我国的和谐社会有着不可忽视的作用和意义。也是我国经济建设和国家改革开放的重要保障。随着社会主义现代化建设的进程不断加快，审计起到的监督作用也越来越明显，就时代的审计主要是通过手工检查账簿来实现的，但是在此之后，计算机技术的快速发展使得信息技术渗入到社会的各个层面，审计工作是会计核算的主要手段，是信息技术面临的挑战。

1.4 光密度分析

在NIKON倒置显微镜下观察切片，分别随机挑选同一采样时间的亚甲基蓝处理组和空白对照组中的切片，在200倍视野下进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。使用Image-Pro Plus6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(Integrated Option Density,IOD)。

1.5 数据的统计学分析

用SPSS 16.0统计软件对各组切片的IOD进行单因素方差分析，以P<0.01为差异极显著，0.010.05为差异不显著，数据以平均值±标准差(Mean ± SD)表示。

2 结果与分析

2.1 黄颡鱼鱼卵中HCE的免疫组织化学检测结果

由图1可见，黄颡鱼鱼卵高卵壳裂解酶(HCE)阳性颗粒在各实验组及各时间点均有明显分布，主要分布在卵黄颗粒和卵膜上。空白对照组与亚甲基蓝组分布位置没有明显区别，但是亚甲基蓝实验组染色程度较高。阴性对照组没有观察到阳性颗粒。

图1 各组黄颡鱼鱼卵HCE的表达(免疫组化染色×200)Fig.1 Expression of HCE in egg of yellow catfish by immunohistochemisty method(×200)

a.空白对照组受精后0 h；b.阴性对照组(亚甲基蓝组受精后0 h)；c1.空白对照组受精后1 h；c2.亚甲基蓝组受精后1 h；d1.空白对照组

受精后2 h；d2.亚甲基蓝组受精后2 h；e1.空白对照组受精后4 h；e2.亚甲基蓝组受精后4 h；f1.空白对照组受精后8 h；f2.亚甲基蓝组

受精后8 h；g1.空白对照组受精后12 h；g2.亚甲基蓝组受精后12 h；h1.空白对照组受精后24 h；h2.亚甲基蓝组受精后24 h；Y.卵黄颗粒Yolk granule；M.卵膜Embryo membrane。

2.2 黄颡鱼鱼卵中高卵壳裂解酶表达随孵化时间的变化

在所有采样的时间点，亚甲基蓝实验组中黄颡鱼卵高卵壳裂解酶(HCE)的积累光密度均高于空白对照组，且差异极显著(P<0.01)(表1),实验组与对照组组内各时间点变化呈波动状态，变化不明显(图1)。

3 讨论

在鱼类人工繁殖的过程中，由于水霉病的爆发而造成的经济损失难以计数。自从孔雀石绿被禁用后，亚甲基蓝、甲醛、食盐、五倍子等防治鱼卵水霉病的药物均被投入生产应用中，并取得了一定的效果。然而关于这些药物对鱼卵的安全性研究仍不够完善。目前国内外对于鱼卵孵化酶的研究已有报道，主要是采用Real-Time PCR法、RACE-PCR法对河川沙塘鳢(Odontobutispotamophila)和雌核发育银鲫(Carassiusauratusgibelio)的高卵壳裂解酶(HCE)基因的部分序列进行了克隆和分析，证明了河川沙塘鳢[5]、雌核发育银鲫[6]中有高卵壳裂解酶存在，但利用免疫组织化学方法对其他我国常见养殖鱼类孵化酶的研究报道较少。鱼卵高卵壳裂解酶的表达会受到溶氧、温度、光照等因素的影响[16]。低浓度(10-5mol/L)的MS-222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate)、肾上腺素以及与Ca2+共存时的二价离子载体A23187(钙镁混合盐，Mixed calcium-magnesium salt)或X537A(拉沙里菌素，lasalocid)可以促进鱼卵高卵壳裂解酶的分泌；而高浓度(10-2mol/L)的MS-222、箭毒块茎碱、阿托品可以抑制鱼卵高卵壳裂解酶的分泌[16]。但是对于水产养殖过程中的常见药物，尤其是用于鱼卵孵化过程中的药物，对高卵壳裂解酶表达的影响尚未见报道。本实验利用免疫组织化学方法检测亚甲基蓝对黄颡鱼鱼卵高卵壳裂解酶表达的影响，弥补了对鱼类高卵壳裂解酶研究的不足。

表1 各实验组鱼卵高卵壳裂解酶(HCE)的累积光密度Tab.1 Integrated option density of hatching Enzyme(HCE)(Mean±SD)

注：采用成对检验方法统计各组间数据，同行字母标注不同者表示差异极显著(P<0.01)。

图2 各实验组鱼卵高卵壳裂解酶(HCE)的累积光密度Fig.2 Integrated option density of hatching enzyme(HCE)(Mean±SD)

亚甲基蓝为印染业废水中的典型有机物之一，但进入水体后会显著提高水体的化学需氧量(COD)，吸收光线，降低水体透明度。且不易被自然光降解[17]。有关染料废水降解研究常常将亚甲基蓝水溶液作为研究模型[18]。我国化学品安全说明书(MSDS)中明确标明亚甲基蓝对水生动物、植物有毒害作用，可能对水体环境产生长期不良影响，应给予特别注意。全称污染物致突变性检测(AMES实验)表明亚甲基蓝有潜在的致癌作用[19]。本检测结果表明，鱼卵被亚甲基蓝浸泡后，高卵壳裂解酶(HCE)累积光密度值显著升高，表明其表达量显著升高。具体原因尚不明确，可能是由于鱼卵自身在污染物胁迫下的一种代偿或应激反应，由此推测亚甲基蓝对胚胎有一定的毒性。

在水产养殖实践中，生产者往往将高浓度的亚甲基蓝废水随意地排放到周围的水体中，对养殖场周边大面积的水域及土壤都造成了严重的污染。尽管目前尚未有直接证据表明亚甲基蓝对水生生物有致畸、致癌、致突变等毒害作用，但是水体中的亚甲基蓝依然会给水环境及水生动植物带来巨大的潜在危害。所以在印染业及水产养殖业中，应当谨慎使用亚甲基蓝。

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TheeffectofmethyleneblueontheexpressionsofhighchoriolyticenzymeintheembroyoofPelteobagrusfulvidraco

LI Hao-ran1,2,DONG Ya-ping1,YANG Liu1,HU Kun1,YANG Xian-le1

(1.NationPathogenCollectionCenterforAquaticAnimals;ShanghaiCollaborativeInnovationforAquaticAnimalGeneticsandBreeding;NationalDemonstrationCenterforExperimentalFisheriesScienceEducation(ShanghaiOceanUniversity),
Shanghai201306,China;2.ShanghaiSummitPropertyDevelopmentCo.Ltd,Shanghai200042,China)

2017-03-28；

2017-07-21

上海市地方高校能力提升项目(17050502100)；上海高校知识服务平台建设项目(ZF1206)；国家科技基础条件平台建设运行项目

李浩然(1990- )，男，硕士研究生，专业方向为水产动物医学。E-mail:hrli@shou.edu.cn

胡 鲲。E-mail:khu@shou.edu.cn

S941.99

A

1000-6907-(2017)05-0053-05