桦褐孔菌菌株的分离鉴定及液体优化培养

郭素萍，赵金芬，董彩虹

1.山西康欣药业有限公司，山西吕梁 030006；2.中科院微生物研究所，北京 100101

桦褐孔菌菌株的分离鉴定及液体优化培养

郭素萍1，赵金芬1，董彩虹2

1.山西康欣药业有限公司，山西吕梁 030006；2.中科院微生物研究所，北京 100101

桦褐孔菌（Inonotusobliquus）是一种十分珍稀而名贵的药用真菌，主要分布在俄罗斯、吉林、黑龙江一带。 桦褐孔菌中的多糖有明显的降血糖作用；桦褐孔菌，又称血液血管的清洁剂，对高血压的防治效果显著。 桦褐孔菌化学成分有多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸,还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。该文通过桦褐孔菌的野外采集、收集，分离纯化得到一株桦褐孔菌菌株，经鉴定为桦褐孔菌，代号：F83280（2014）；通过对该菌株的液体发酵优化培养，得到该菌株F83280（2014）液体培养最佳的培养基配方及培养工艺条件，为今后开展药效学研究提供了样品及可靠数据。

桦褐孔菌；新菌株；分离鉴定；液体培养

桦褐孔菌属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。是一种生于桦树上的药用真菌，其子实体呈现类似于碳的黑色块状形态。外表黑灰，有不规则沟痕，内部黄色，无柄，直径25～40 cm，深色，表面深裂，很硬。菌肉木柱质，有轻微的、模糊不清的环纹，鲜（明亮）淡黄褐色。桦褐孔菌是前苏联各共和国、波兰、日本等国的民间常用药物，人们已从菌核和菌丝中提取到一种糖蛋白（FIS-1）和一种水溶性多糖（F1），发现均有明显的降血糖作用。尤其是水溶性多糖 （F1），一次性给药50 mg/kg体重，3 h后，高血糖鼠的血糖含量下降近一半，且可维持48 h之久；桦褐孔菌，又称血液血管的清洁剂，对高血压的防治效果显著。相关文献载：俄罗斯堪索莫乐斯基制药公司生产的桦褐孔菌精粉对高血压的有效率达93%，桦褐芝被广泛应用于2型糖尿病的科研和临床。当桦褐孔菌10～15年后起药效时，它能吸干桦木的精髓，使树木枯死。桦褐孔菌主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、中国海南、日本（北海道），滋生在北半球北纬40～50°的地区。

1 菌种的分离鉴定

培养特征：28℃恒温培养10 d，肉眼逐日观察菌丝形态变化，培养3 d后平皿中央菌快周围有白色绒状菌丝出现；培养5 d后，菌落不断扩展，菌丝白色逐渐加粗；培养8 d后，菌落扩展到平皿1/2，菌丝体逐渐匍匐于培养基上，由白色逐渐变黄；培养10 d后，菌落继续扩展，菌丝体由黄色向棕色转变，并有模糊的环纹出现，菌落表面有菌孔，并出现黄褐色液珠，镜检无孢子产生。如图1、图 2。

图1 F83280（2014）菌株斜面培养

图2 F83280（2014）菌株培养皿培养10 d后的情况

2 桦褐孔菌F83280（2014）液体培养基优化筛选

2.1 基础培养基选择

摇床培养条件：28℃150 rpm/min，根据文献选择了如下3种培养基进行了初步试验。鉴定结果为：桦褐孔菌 Inonotus obliquus(Ach.ex Pers.)Pilát 1942。分类地位：Hymenochaetaceae,Hymenochaetales,Incertae sedis,Agaricomycetes,Agaricomycotina,Basidiomycota,Fungi。

图3 F83280（2014）337显微形态观察情况

2.1.1 PDB培养基 观察摇床培养的菌种F83280（2014）PDB液体培养基的生长状况，4 d生长缓慢，不适合PDB液体培养基，需要重新配置新的液体培养基。

2.1.2 黄豆粉培养基 葡萄糖20 g/L，黄豆粉30 g/L，KH2PO4，3 g/L，MgSO41.5 g/L VB10.1 g/L，pH6 左右。

2.1.3 葡萄糖蛋白胨酵母提取物培养基 葡萄糖20 g/L，大豆蛋白胨 3 g/L，酵母提取物，2 g/L KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，VB10.1 g/L，pH6左右。3种培养基中均长势较差。

2.2 接种方式的选择

考虑到PDB培养基和黄豆粉培养基中长势均较差，所以摸索了接种方法。

①整个平板337A加40 mL水碾碎，取5 mL接种。见图4。

按照此方法接种，菌种生长速率明显提高，只是方法比较麻烦，接种量不能很好控制。

②采用搅拌机，将平板菌种打碎后接种，效果明显。因此后面均采用该方法。

2.3 碳源试验

选用黄豆粉培养基为基础培养基：葡萄糖20 g/L，黄豆粉 30 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4，1.5 g/L，VB1 0.1 g/L，pH6左右。用可溶性淀粉，糊精，蔗糖，乳糖，麦芽糖，白砂糖，山梨醇，甘露醇，结晶纤维素等替换发酵培养基中的葡萄糖，每个处理重复3次，一组对照试验，不添加任何碳源，其他与发酵培养基相同。其离心烘干，测其干重，SPASS结果分析如下。

图4 F83280（2014）337A平板培养好后，加40 mL水碾碎，取5 mL接种

从表1中碳源、氮源的比较试验中可以看出，以葡萄糖作为碳源效果最好，其次是糊精、蔗糖。

2.4 氮源试验

用(NH4)2SO4，NaNO3，KNO3等替换基础培养基中的黄豆粉，结果见表1。从表1中碳源、氮源的比较试验中可以看出，以蛋白胨为氮源最好，其次是牛肉膏、酵母提取物。

表1 碳源、氮源的比较试验[（±s），g/L]

表1 碳源、氮源的比较试验[（±s），g/L]

碳源 菌丝干重 氮源 菌丝干重单糖类D-(-)-阿拉伯糖D-(+)-木糖D-(-)-果糖D-(+)-半乳糖D-(+)-葡萄糖双糖类D-(+)-纤维二糖乳糖麦芽糖蔗糖多糖类纤维素糊精麦芽提取物果胶可溶性淀粉糖醇类D-甘露醇D-山梨醇有机酸柠檬酸对照（没有碳源）1.96±0.18 2.05±0.03 3.12±0.34 3.25±0.53 6.69±0.40 4.73±0.24 3.51±0.20 5.33±0.25 6.26±0.25 ND2 5.08±0.48 4.00±0.07 2.69±0.32 4.80±0.09 4.45±0.05 4.05±0.66 2.51±0.82 2.72±0.11无机氮硝酸铵硫酸铵氯化铵硝酸钾硝酸钠尿素氨基酸甘氨酸L-天冬氨酸L-谷氨酸L-敕氨酸L-甲硫氨酸e L-色氨酸复合氮源牛肉膏干酪素蛋白胨酵母提取物对照(没有氮源)2.67±0.28 2.18±0.24 2.22±0.12 3.62±0.25 2.85±0.16 2.03±0.23 1.72±0.11 3.12±0.26 2.97±0.11 1.99±0.19 2.05±0.04 2.04±0.19 5.84±0.52 ND 6.58±1.32 3.97±0.43 2.74±0.18

2.5 碳氮比值

根据碳氮源试验的结果，在下述营养需求的试验中蔗糖和蛋白胨分别用作碳氮源。

如表2所示配制8种不同的碳氮比值但是有相同的总有机物质含量的培养基。

表3中可以得出，菌丝生长的最适C/N为12：1，高或低于12：1时菌丝生物量都会下降，但是C/N为12：1时的生物量和 C/N 为 6：1，18：1，24：1，36：1 和 48：1 时的生物量没有显著性差别。

表2 不同碳氮比值的液体培养基组成

表3 碳氮比值对冬虫夏草菌菌丝生长的影响[（±s），g/L]

表3 碳氮比值对冬虫夏草菌菌丝生长的影响[（±s），g/L]

碳氮比值 菌丝干重1:1 6:1 12:1 18:1 24:1 36:1 48:1 96:1 1.10±0.44 6.02±1.09 7.10±0.29 6.48±0.68 5.85±0.53 5.86±0.40 5.87±0.82 5.03±0.21

表4 正交试验L8（27）优化菌丝生长的半合成培养基

表5 正交试验设计L8(27)的方差分析

2.6 碳氮源浓度优化

从表4和表5中可以看出：通过应用上述优化的最佳培养基验证试验，得到平均生物量为22.15 g/L，与正交试验中相同浓度组合的培养基生物量23.69 g/L相近，表明优化得到的培养基实践中是可靠的。

3 结论

适合桦褐孔菌菌丝生长的培养基组成为葡萄糖30 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 0.5%，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，VB10.1 g/L，pH6，温度 28～30°C。其关键为接种方式，最好采用搅拌机将种子打碎接种。

[1]孙海峰,孙慧峰,郭冷秋,等.均匀设计优化桦褐孔菌多糖提取工艺的研究[J].世界科学技术：中医药现代化,2011，13（1）：124-128.

[2]何坚,冯孝章.桦褐孔菌化学成分的研究[J].中草药,2001,32（1）：4-6.

[3]黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌—桦褐孔菌[J].中国食用菌，2002，21（4）：7-8.

[4]陈艳秋.桦褐孔菌菌株遗传多样性及人工培养条件优化模式研究[D].吉林农业大学，2007.

R931.5 [文献标识码]A [文章编号]1672-5654（2017）08（c）-0052-04

2017-05-19）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.24.052

国家科技部国际科技合作项目：特殊蕈菌资源挖掘及评价利用的联合研发（2014DFR31050）。

郭素萍（1960-），女，山西五台人，本科，教授级高级工程师，主要从事微生物菌种选育、分离、培养及药用真菌研究工作。