苹果渣浸提液乳酸发酵剂的研究

杨 辉， 闫晓哲， 蒲鹏飞， 苏 文， 杜娇娇， 彭任芳

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

苹果渣浸提液乳酸发酵剂的研究

杨 辉， 闫晓哲， 蒲鹏飞， 苏 文， 杜娇娇， 彭任芳

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

苹果渣综合利用是苹果产业发展的技术瓶颈之一，为了探索苹果渣高值利用的新途径，本文以水为溶剂制取苹果渣浸提液，接种不同组成及比例的混合乳酸菌，通过考察混合乳酸菌发酵液中乳酸菌量、产酸耗糖量等指标变化，确立理想的乳酸发酵剂组成.研究结果表明嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌，按2∶1∶2∶3∶4比例配比，接种量4 mL/100 mL，初始pH=6.3时发酵36 h，发酵液中活菌数达到12.35×108CFU/mL，产酸量达到14.45 g/L，耗糖量29.37 g/L，为苹果渣乳酸发酵的高值利用及苹果渣乳酸发酵粉的制备提供试验基础.

菌种； 菌种比例； 乳酸菌； 果渣浸提液

Abstract:Pomace utilization is one of the technical bottlenecks in development of apple industry.In order to explore the new way of high utilization of apple pomace,in this paper the pomace was used to prepare extract liquid using water as the solvent,then the extract was inoculated with different compositions and proportions of mixed lactic acid bacteria.The ideal component of the lactic acid starter and its optimal fermentation conditions were determined by selecting the lactic acid bacteria,measuring the total bacteria count in fermented broth,detecting the consumption of sugar.The results showed thatLactobacillusacidophilus,Lactobacillusrhamnosus,Lactobacillusplantarum,BifidobacteriumthermophilusandStreptococcusthermophiluswere mixed in the proportion of 2∶1∶2∶3∶4,inoculation amount 4 mL/100 mL,fermented for 36 h,at a natural pH 6.3，the number of viable cells in the fermented mash reached 12.35×108CFU/mL and the acid yield reached 14.45 g/L.The sugar consumption was 29.37 g/L.The obtained results can provide technology support to utilize pomace efficiently and prepare lactic acid bacteria powder for pomace fermentation.

Keywords:culture; bacterial proportion; lactic acid bacteria; pomace extract

0 引言

苹果是我国盛产水果之一，栽种面积大，产量高，20%用于深加工，且加工量的90%用于苹果浓缩汁的生产，副产物果渣产量每年达24～26万t[1]，其中70%果渣被废弃.苹果渣中含有可溶性糖、粗纤维、果胶、酚酸等物质[2]，其中可溶性糖、粗纤维、果胶的含量分别占干重的9.5%～22.6%、10.5%、1.5%～4%[3]，其含有的生物活性物质具有抗氧化性、降低胆固醇和减肥的作用，具有很大的开发价值.

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是指发酵碳水化合物产生50%以上乳酸的一类细菌总称[4]，其中双歧杆菌是人类肠道中有益菌群的代表之一[5]，它们可以在人体肠道中生长繁殖，并通过抑制病原体生长[6]，维持肠道有益菌群的平衡，来保持人体健康[7,8].

近年来，有关乳酸菌和双歧杆菌的医疗保健作用及其机理研究不断深入，其相应的保健食品陆续问世，并且市场份额越来越大.赵鑫等[9]研究了不同比例的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌对酸奶品质的影响发现，当改变乳酸菌的比例可以调节酸奶的风味和货架期.卢兆芸等[10]利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌通过乳酸新型发酵工艺发酵紫红薯酸牛奶，其产品风味芳香、营养丰富、口感好.张明等[11]研究了以葡萄糖为碳源的鼠李糖乳杆菌饮料发酵工艺，并制备了活菌数为8.5×108CFU/mL，沉淀率为1.1 %的乳酸饮料.汪立平等[12]利用4种植物乳杆菌为菌种，制得发酵萝卜泡菜的发酵剂.安兴娟等[13]优化了植物乳杆菌发酵枸杞和红萝卜混合汁的工艺，并得到了色泽均匀、口感酸爽柔和的果味饮品.

在上述众多的研究和乳酸产品的生产中，乳酸菌的品质及获取无疑是重要的，基于此，结合苹果渣综合利用的紧迫需求，本文提出以水为溶剂浸提苹果渣的营养物质，以此进行混合乳酸发酵.本实验首先从收集到的菌中筛选出五种乳酸菌和一株双歧杆菌进行不同的组合，然后对其发酵过程进行研究，确定适于果渣浸提液乳酸发酵的菌种组合和配比，为果渣乳酸发酵菌粉的制备提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 主要材料

旬邑红富士苹果，成熟度好、无虫害、无机械损伤，市售；碳酸钠，分析纯，天津市红岩化学试剂厂；柠檬酸，分析纯，湖南湘中化学试剂开发中心；葡萄糖，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；次甲基蓝，分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司；酒石酸钾钠、硫酸铜，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司.

1.2 菌种

嗜酸乳杆菌(L9)、保加利亚乳杆菌(L10)、鼠李糖乳杆菌(L20)、植物乳杆菌(L60)、双歧杆菌(BB28)、嗜热链球菌(L70) ，由陕西科技大学1C419实验室提供.

1.3 培养基

MRS琼脂培养基、MRS肉汤，生化试剂，北京陆桥技术股份有限公司；M17培养基，生化试剂，青岛高科园海博生物技术有限公司.

(1)MRS琼脂培养基：蛋白胨 10.0 g/L、牛肉粉 5.0 g/L、酵母粉 4.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、吐温80 1 mL/L、磷酸氢二钾 2.0 g/L、乙酸钠 5.0 g/L、柠檬酸三铵 2.0 g/L、硫酸镁 0.2 g/L、硫酸锰 0.05 g/L、琼脂15.0 g/L；

(2)MRS肉汤: 蛋白胨 10.0 g/L、牛肉粉 10.0 g/L、酵母粉 5.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、硫酸镁 0.1 g/L、醋酸钠 5.0 g/L、柠檬酸铵 2.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸锰 0.05 g/L、吐温80 1 mL/L；

(3)M17培养基：大豆胨 5.0 g/L、蛋白胨2.5 g/L、酪蛋白胨 2.5 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、牛肉粉5.0 g/L、乳糖 5.0 g/L、抗坏血酸0.5 g/L、β-甘油磷酸钠19.0 g/L、硫酸镁0.25 g/L.

1.4 仪器

恒温培养箱，山东潍坊医疗器械厂；电子分析天平，赛多利斯(北京)科技有限公司；pHS-4C+酸度计，成都市方舟科技开发公司；DK-S24型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；榨汁机，广东美的精品电器制造有限公司；YX-24LDJ型灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司.

1.5 实验方法

将新鲜苹果分切四块，置于榨汁机中制取果渣.取新鲜果渣40 g和新鲜切块的苹果30 g混合打浆，加入0.1%VC溶液护色，按料液比7∶3(W∶V)加入30 mL蒸馏水进行浸提，90 ℃～92 ℃灭菌20 min，待冷却后添加0.6 g/L的果胶酶，50 ℃下酶解4 h，过滤得到澄清浸提液.取苹果渣水提取液100 mL，按设计接入4 mL活菌数在108CFU/mL的乳酸菌培养液，于pH 6.3、温度37 ℃～39 ℃条件下发酵约36 h.然后，对发酵液进行乳酸菌计数，菌液分离后，测定总滴定酸、耗糖量，以发酵液中活菌数为主要指标，残糖和总酸为参考指标，筛选菌种或菌种组合.

1.5.1 单因素试验

(1)单一菌种发酵

分别利用L9、L10、L20、L60、BB28、L70进行发酵，选取一种较优菌种.

(2)两组合菌种发酵

两种菌种接种量比例为1∶1，根据表1中的组合方式分别进行发酵，选一较优菌种组合.

表1 两种菌种组合表

(3)三组合菌种发酵

三菌种接种量比例为1∶1∶1，根据表2中的组合方式分别进行发酵，选一较优菌种组合.

表2 三种菌种组合表

(4)四组合菌种发酵

四菌种接种量比例为1∶1∶1∶1，根据表3中的组合方式分别进行发酵，选一较优菌种组合.

表3 四种菌种组合表

(5)五组合菌种发酵

五菌种接种量比例为1∶1∶1∶1∶1，根据表4中的组合方式分别进行发酵，选一较优菌种组合.

表4 五种菌组合表

(6)菌株组合的选取

将以上5组单因素中选出的菌株组合与六种菌株组合接种发酵.以发酵液中活菌数为主要指标，总酸和耗糖为参考指标，选取较佳菌株组合.

1.5.2 菌株配比的选择

根据选出较优组合L9 L20 L60 BB28 L70，保证接种量4%不变，对于每个菌株设置4个梯度分别进行实验.具体组合安排见表5.以发酵液中活菌数为主要指标，总酸和耗糖为参考指标，选取较佳菌株配比.依据此五种菌比例进行发酵，考察最适菌组合产酸和耗糖性能.

表5 接种量配比

1.5.3 分析方法

总酸的测定按国标GB/T12456-2008方法测定；总糖的测定按国标GB/T15038-2006方法测定；发酵液中活菌数按国标GB 4789.3-2016方法测定.

1.6 数据处理

采用Excel、Spss软件对实验数据进行处理，利用Origin进行画图.

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

本试验选择的菌种L9、L10、L20、L60、BB28、L70它们能够利用一些寡糖和葡萄糖等单糖作为主要的碳源生产乳酸，且被广泛研究和应用，因果渣中以葡萄糖、果糖等单糖为主，故它们适于苹果渣发酵，同时它们之间存在着数量上的平衡，功能上的协调，营养上的互补等[14]，这些是维护肠道菌群平衡、代谢健康的前提和基础，基于此本文对单一乳酸菌发酵、混合菌发酵条件进行研究，并且探索它们之间的比例关系，确定苹果渣乳酸发酵剂的组成.

2.1.1 单一菌种发酵

六株菌种单独发酵，结果如图1所示.图1结果表明L20为较优发酵菌种.所选菌种L9可以利用一些蛋白质的水解产物和一些单糖和寡糖进行同型发酵[15]，但果渣浸提液中缺少生长刺激物，在发酵时产酸速度慢，生长缓慢.对于L10，当发酵液pH值在3.5左右时， 细胞内外pH梯度差减少，新陈代谢活动开始受到抑制[16,17]导致发酵滞后，因此，L10在发酵液中菌量较少.BB28是严格厌氧的异型发酵菌，在发酵过程中，浸提液内残留的氧气影响丙酮酸酶活性，导致丙酮酸积累进而影响其生长[18]，发酵液中活菌数最低.而果渣浸提液中缺乏L70所需氨基酸、肽类、维生素之类的生长辅助因子[19]，使其生长条件受到限制，发育不良，因此发酵情况也不好.相比之下，L20是从健康人体肠道中分离出的一种益生菌[20]，具有良好的耐酸能力[21]，对于不良环境的适应能力优于其他乳酸菌和一些益生菌[22]所以生长旺盛，发酵水平较高；L60有较强的发酵碳水化合物的能力[23]但发酵能力不及L20.综上所述，选择L20为较优发酵菌种.

图1 单一菌株发酵结果

2.1.2 两组合菌种发酵

两组合菌种发酵，其结果如图2所示.根据图2描述各组合发酵结束时活菌数可知，组合6(L10L20)活菌数含量较高.L20的主产物是乳酸而且具有良好的耐酸机制，能够适应高酸环境，持续发酵.L10是一种常用的发酵菌种[24]， 其本身能够代谢产生多种氨基酸从而促进L20的代谢过程，并且本身耐酸，发酵后期仍能生长发育.

图2 两组合菌种发酵结果

2.1.3 三组合菌种发酵

三组合菌种发酵，其结果如图3所示.图3结果表明，组合6(L9 L20 BB28)比较适合苹果渣发酵.在BB28代谢过程中少量氧气存在都会产生丙酮酸的积累，同时，L9和L20是通过EMP途径进行糖酵解的，丙酮酸是其中间代谢产物[18]，有利于EMP途径的进行.L9和BB28有很强的耐酸性和抑菌能力，有利于后续发酵[18].张香美等[25]通过研究双歧杆菌和嗜酸乳杆菌发现双歧杆菌促进嗜酸乳杆菌生长增殖，嗜酸乳杆菌对双歧杆菌无明显的促进或抑制作用，两菌在混合培养体系中有良好的微生态关系.L20的终端产物是乳酸，对于L9的生长有明显的促进作用，同时L9分解蛋白质产生游离氨基酸可以促进L20和BB28的生长.

图3 三组合菌种发酵结果

2.1.4 四组合菌种发酵

四组合菌种发酵，其结果如图4所示.图4表明组合5(L9 L20 L60 L70)为较佳发酵菌种组合.组合5中L9代谢可以产生赖氨酸、精氨酸、缬氨酸等游离氨基酸，这些游离氨基酸能够促进L20 L60 L70的生长和繁殖[26,27]，L70代谢产生的甲酸和CO2能够促进L9的生长，L20产生的乳酸也能够促进L9的生长繁殖.相比于乳制品，果渣浸提液中营养匮乏，L20适应恶劣环境能力较强[21]，能够在果渣浸提液中生长繁殖.L60发酵碳水化合物的能力较强[23]，同时在L60发酵体系中有氨基态氮含量较高能够促进L9 L20 L70的生长.所以组合5发酵能力较佳.

图4 四组合菌种发酵结果

2.1.5 五组合菌种发酵

五组合菌种发酵，其结果如图5所示.由图5可知，菌种组合2(L9 L20 L60 BB28 L70)比较适合苹果渣浸提液发酵.组合2中L9发酵产生的缬氨酸、精氨酸、赖氨酸等氨基酸能够促进乳杆菌和BB28的生长，同时L70产生的甲酸和CO2能够促进L9的繁殖代谢，它们有一定的促进作用[25,26].BB28与L70之间也存在协同效应[27]，同时由于微量氧气的存在BB28发酵体系中丙酮酸积累[18]，将促进其他几种乳酸菌代谢.L20对于环境的适应较强[21]，而且L60对于普通碳水化合物的发酵能力较强[23]体系中氨基态氮含量增加，为L20和BB28后期的发酵创造条件，所以组合2能够充分发挥各组合菌的代谢优势.

图5 五组合菌种发酵结果

2.2 较佳菌种配比的选择

利用较佳菌种组合与六种菌种全部进行对比试验如图6所示.

图6 较佳组合乳酸菌与其他 组合菌组发酵结果比较

图6中组合5(五种菌株组合)是上述研究的最适组合，相比四种菌株组合多了BB28菌，由于发酵前期微量的氧气存在，使BB28在发酵过程中大量积累丙酮酸，而丙酮酸是EMP途径中重要的中间代谢产物，对于菌体的繁殖代谢至关重要，所以最适五菌组合发酵效果较佳.在六菌组合中，虽然保加利亚乳杆菌与其他菌种存在共生关系，可能因为在保持接种量4 mL/100 mL不变时，各菌种接种量减少，其代谢产物减少，前三组合有很好促进作用但是相比于第四组和第五组合促进关系不明显，故选择组合L9 L20 L60 BB28 L70.

2.3 混合菌种接种量配比选取

2.3.1 各组成菌比例选择

不同接种比例发酵，其结果如图7所示.由图7(a)可以看出组合3、5发酵效果较好且接近，由图7(b)可以看出组合5耗糖量优于组合3，故可知当组合为L9L20L60BB28L70五种菌配比比例为组合5(2∶1∶2∶3∶4)较好.接种比例最大的是L70，L70的产物乳酸、甲酸、CO2能够不同程度刺激L9的生长发育.其次是BB28，在发酵前期，由于氧气的存在使丙酮酸大量积累，为其他菌株生长代谢提供中间产物.L9和L60都可以产生氨基酸，共同促进L20产酸，L20产酸又来促进L9的代谢发育，同时L20和L9都有耐酸性，为后期持续发酵创造条件.

(a)发酵活菌数

(b)发酵结束时耗糖图7 不同接种比例发酵结果

2.3.2 最适组合乳酸菌剂产酸和耗糖性能检验

乳酸菌的产酸量和耗糖量是乳酸发酵剂的重要性能.2.3.1的研究中以发酵液中乳酸菌数作为考量指标选出了五菌种组合的比例，没有考察该组合菌的产酸量和耗糖指标，验证试验对此进行了考察，结果如图8所示.

图8结果表明， 最适菌种组合为L9 L20 L60 BB28 L70，在接种量4%，各菌种添加比例为2∶1∶2∶3∶4时进行发酵，发酵剂具有良好的菌增殖效果，同时具有较好的产酸能力和耗糖量，发酵液中活菌数可达到12.35×108CFU/mL，乳酸量14.45 g/L，耗糖量29.37 g/L.

图8 最适五菌组合乳酸发酵剂 产酸和耗糖性能

3 结论

(1)以苹果渣水浸提液为发酵培养基，5种乳酸菌-嗜酸乳杆菌(L9)、鼠李糖乳杆菌(L20)、植物乳杆菌(L60)、双歧杆菌(BB28)、嗜热链球菌(L70)的混合发酵优于单一菌种或其他混合菌的乳酸发酵.

(2)混合菌组配比例是影响乳酸发酵的重要因素，当上述五种菌接种比例为2∶1∶2∶3∶4时有良好的发酵效果，其中上清液中活菌数可达到12.35×108CFU/mL，乳酸量可以达到14.45 g/L，耗糖量29.37 g/L，说明此发酵组合能够充分利用苹果渣培养基中的糖分，并能较好的将其转化为乳酸，有利于乳酸菌的增殖.

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【责任编辑：蒋亚儒】

Studyonlacticacidstarterofapplepomaceextractfermentation

YANG Hui, YAN Xiao-zhe, PU Peng-fei, SU Wen, DU Jiao-jiao, PENG Ren-fang

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

2017-08-19

陕西省科技厅技术转移与科技成果推广引导计划项目(2017CG-003)

杨 辉(1960-)，男，陕西西安人，教授，博士生导师，研究方向：生物材料和发酵工程

2096-398X(2017)05-0139-06

TS255.2

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