彗星试验检测地下水有机污染物的遗传毒性效应

刘瑞祥，边高鹏，兰婷婷，孙学茹，常惠丽，任嘉红

1. 长治学院生物科学与技术系，长治 0460112. 太行山生态与环境研究所，长治 0460113. 长治市环境监测站，长治 046000

彗星试验检测地下水有机污染物的遗传毒性效应

刘瑞祥1, 2, *，边高鹏1, 2，兰婷婷1，孙学茹1，常惠丽3，任嘉红1, 2

1. 长治学院生物科学与技术系，长治 0460112. 太行山生态与环境研究所，长治 0460113. 长治市环境监测站，长治 046000

应用人外周血淋巴细胞和小鼠淋巴细胞彗星试验，对长治市5个样点的地下水有机浓集物进行了遗传毒性研究。结果表明，各水样中有机浓集物在3个染毒剂量50，200，800 mL·管-1条件下均可对人外周血淋巴细胞和小鼠淋巴细胞DNA产生不同程度的遗传损伤，并且随着浓度的升高，DNA损伤程度明显增加，各实验组与溶剂对照组相比有P < 0.05或P < 0.01显著差异。研究表明，上述2种淋巴细胞彗星试验可有效地检测地下水体有机污染物的遗传毒性。

地下水；有机污染物；彗星试验；人外周血淋巴细胞；小鼠淋巴细胞

Received17 November 2016accepted17 December 2016

Abstract: The genotoxicity of organic pollutants to human peripheral lymphocytes and mouse lymphocytes in Changzhi groundwater was investigated. The comet assay was conducted to detect DNA damage induced by the organic extracts of five typical sample sites. The results showed that the DNA damage in human peripheral lymphocytes and mouse lymphocytes was induced by the organic substances tested in 50，200 and 800 mL·tube-1. DNA damage increased obviously with the dose of the organic extracts. Significant differences (P<0.05, P<0.01) were observed compared with the negative control group. This study also demonstrated that comet assay could be successfully applied to the genotoxicity monitoring of water organic extracts in human peripheral lymphocytes and mouse lymphocytes.

Keywords: ground water; organic pollutants; comet assay; human peripheral lymphocytes; mouse lymphocytes

地下水是人类重要的饮用水源，然而地下水污染尤其是有机污染日益突出的问题，已引起国际社会的广泛关注[1]。1987年美国国家环保局(U.S. Environmental Protection Agency，USEPA)已在地下水中发现了175种有机化合物[2]，我国国土资源部于2005年始开展全国地下水污染调查与评价，结果表明珠江三角洲、长江三角洲、淮海流域平原区、华北平原等区域地下水有机污染明显[3]。由于此类有机物大都呈现低剂量长期暴露的特点，传统的理化分析方法不足以对水质状况做出全面的综合评价，因此，有必要建立一种有效的测试方法来评价水体中有机物对生物、特别是对人体的遗传毒性，以准确直观地反映水体的综合毒性以及对人体健康的潜在危害。

彗星实验，又称单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)，自20世纪90年代以来已广泛应用于水污染遗传毒性监测。张金荣等[4]应用彗星试验技术探讨了自来水中有机污染物对细胞DNA的损伤作用，表明自来水中非挥发性有机污染物对细胞DNA有断裂损伤作用。厉以强等[5]采用人血淋巴细胞彗星试验检测南京市水源水的遗传毒性，证实了其用于检测饮用水源有机浓集物遗传毒性的可行性。李兆利等[6]运用人外周血淋巴细胞彗星试验对长江南京段水体中有机污染物的遗传毒性进行了研究，指出有机污染物是导致长江南京段水体遗传毒性的主要因素。本文采用人外周血淋巴细胞和小鼠淋巴细胞彗星试验，对长治市地下水体中有机浓集物的遗传毒性进行了研究，探讨地下水有机污染对人体健康危害的生物预警检测评价方法。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

健康人外周肝素抗凝全血，由长治市和济医院提供。SPF级昆明种雄性小鼠，6～8周龄，30～32 g，由长治市康宝工业园实验动物培训基地提供。

1.2 水样采集与处理

在长治市市区及周边县区选取5个样点，分别为长治市城区、长子县、沁源县、武乡县和潞城辛安泉，其中辛安泉为长治市集中式地下水型水源地。于2016年3月从每个样点采集水样各10 L，各取水点均为本地区主要城镇居民集中地水源井，井深100～350 m，在监测井水面0.5 m以下取样。采集水样时利用抽水机设备，采样前启动设备放水数分钟，将积留在管道内的杂质及陈旧水排出，然后用采样容器在泵房出水管放水阀处接取水样。静置24 h后，过滤去除悬浮颗粒。采用XAD-2树脂(Solarbio公司)吸附柱富集，控制流速在30～40 mL·min-1。N2排除水分，以甲醇、丙酮、二氯甲烷各50 mL洗脱，洗脱液用氮吹仪在50 ℃下浓缩、吹干，再用二甲基亚砜(DMSO)定容至10 mL，避光保存于-18 ℃冰箱中备用。

1.3 试验方法

1.3.1 人外周血淋巴细胞彗星试验

(1)人外周血淋巴细胞分离和染毒

将2 mL新鲜肝素抗凝血与5 mL 3%明胶混合于离心管中，37 ℃水浴沉降30 min，吸取淡黄色淋巴细胞层0.2 mL于事先装入0.8 mL PBS缓冲液的微量离心管中，3 000 r·min-1，离心5 min，弃去上清。加入0.9 mL PBS及0.1 mL水样浓集物，4 ℃冰箱中暴露1 h，每个水样设3个剂量(即相当于原水样50、200、800 mL·管-1)，同时作DMSO溶剂对照，每个剂量设3个平行。染毒后3 000 r·min-1离心5 min，弃去上清，沉积细胞置4 ℃冰箱中备用。铺胶前用苔盼蓝染色观察细胞存活率(> 90%)。

(2)彗星试验及结果评价

彗星试验采用经修改过的Singh等[7]的方法和OxiSelectTMComet Assay Kit(Sigma)进行。铺好胶的玻片在冷的细胞裂解液于4 ℃裂解1 h，然后置于碱性电泳缓冲液中，4 ℃下解旋20 min。10 V，80 mA条件下电泳40 min后4 ℃下用冷的PBS缓冲液中和3次，5 min·次-1；用Vista Green DNA Dye染色，50 μL·well-1，10 min后即可在荧光显微镜下观察并进行损伤评价和分析。

一个典型彗星包括头部和尾部，不同程度的损伤根据可见荧光的尾部与其头部的比例大小分为0、1、2、3、4五个等级。每张玻片观察100个左右细胞，计算细胞损伤专用单位(arbitrary units，AU)[8]，计算方法如下：

式中，i为损伤等级；Ni为i级的细胞数。

采用SPSS 17.0软件做统计分析，以单因素方差分析(ANOVA)比较各剂量组与溶剂对照组间的损伤差异，P <0.05, P <0.01表示差异显著。

1.3.2 小鼠淋巴细胞彗星试验

(1)小鼠淋巴细胞分离和染毒

小鼠淋巴细胞分离参照文献[9]的方法。常规眼眶静脉采集400 μL血液于预先加入50 μL的1 g·L-1肝素钠EP管中，按1:2.5的比例加入明胶分离液，37 ℃水浴锅中静置约40 min。吸取上层淡黄色淋巴细胞液0.2 mL于预先装有0.8 mL PBS缓冲液的微量离心管中混匀，3 000 r·min-1离心5 min，弃上清，每管加入0.9 mL PBS及0.1 mL水样浓集物，4 ℃冰箱中染毒1 h，每隔10 min用移液枪吹打一次。剂量设定同人血淋巴细胞彗星试验。染毒后3 000 r·min-1离心5 min，弃上清，置4 ℃冰箱中备用。同时作DMSO溶剂对照。

(2)彗星试验及结果评价

同人血淋巴细胞彗星试验。

2 结果(Results)

2.1 人外周血淋巴细胞彗星试验

各水样中有机浓集物对人外周血淋巴细胞的DNA损伤程度见表1。由表1可知，各水样有机浓集物均可引起人外周血淋巴细胞不同程度的遗传损伤，与溶剂对照组相比，均呈现出显著差异(P < 0.01)，并且随着染毒剂量的增加，DNA损伤程度亦逐渐增大。此外，由表1还可以看出，在DMSO溶剂对照组中，细胞几乎没有损伤，有近90%的细胞集中在0级，仅有10%的细胞受到损伤，且全部集中在1级；低剂量组(50 mL·管-1)DNA损伤集中于1、2级(61.54%～88.26%)，潞城辛安泉除外，0级损伤接近60%；高剂量组(800 mL·管-1)有2个样点细胞损伤严重而难以统计，细胞无明确头部或头尾分离，其余3个样点在该剂量组4级损伤均大于5%，显微镜下观察可见很小的彗星头和长而大的彗星尾。

2.2 小鼠淋巴细胞彗星试验

各水样中有机浓集物对小鼠淋巴细胞的DNA损伤程度见表2。由表2可以看出，各水样有机浓集物对小鼠淋巴细胞均能造成不同程度的遗传损伤，与溶剂对照组相比，具有P < 0.05或P < 0.01显著差异。由表2还可看出，溶剂对照组对细胞的损伤极小；低剂量组(50 mL·管-1)DNA损伤多集中于1级，其中武乡县和潞城辛安泉在该剂量组0级损伤大于80%；高剂量组(800 mL·管-1)对DNA损伤多集中于3级，4级损伤均小于5%。

表1 各水样有机浓集物对人外周血淋巴细胞的DNA损伤Table 1 DNA damages in human peripheral blood lymphocytes exposed to organic extracts from different water samples

注：与溶剂对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。下同。

Note: Compared with the solvent control group，*P < 0.05，**P < 0.01. The same below.

3 讨论(Discussion)

彗星试验是常用的遗传毒性生物学测试方法，可在单细胞水平上检测DNA损伤，具有快速、灵敏、简便等优点[10～12]。用于彗星试验研究DNA损伤的细胞有许多种，如淋巴细胞、肝脏细胞、各种肿瘤细胞、睾丸细胞等。其中，外周血淋巴细胞具有易于采集、可连续取样、对机体损伤小、可用于活体检测等优点被广泛采用。本研究结果显示，长治市各水样中有机浓集物可导致人外周血淋巴细胞、小鼠淋巴细胞DNA不同程度的遗传损伤。

人外周血淋巴细胞是彗星试验最常用的生物材料之一，广泛应用于人群流行病学调查、环境监测、临床疾病诊断等[13～14]。厉以强等[15]、常惠丽等[16]研究表明，人血淋巴细胞彗星试验可有效地检测水体中有机污染物的遗传毒性。也有研究表明[17]，有机污染物对小鼠的遗传毒性可以很好地反映其对哺乳动物、特别是对人的危害作用，从而及时地预测预报对人体的危害。本研究发现，地下水有机浓集物对人外周血淋巴细胞的损伤作用更为明显，其中染毒剂量在800 mL·管-1条件下有2个样点出现了超过20%的细胞头部模糊、拖尾较长的现象，通常这类细胞的出现率应低于5%，特别是对照组，若出现在实验组中，则表明处理因素对细胞已经产生致死性效应，而非遗传毒性效应。研究显示，该剂量组下各样点有机浓集物对小鼠淋巴细胞损伤等级均小于5%，说明人血淋巴细胞DNA比小鼠淋巴细胞DNA对有机物更为敏感；也可能与不同动物细胞对有机毒物的毒性敏感性及DNA损伤修复机制的差异性有关，这有待于今后进一步研究。

实验组中高剂量染毒使DNA造成重度损伤，已引起了人血淋巴细胞凋亡，而剂量过低又难以使损伤充分体现。以200 mL·管-1这一剂量组进行多重比较，对人血淋巴细胞DNA损伤程度依次为：长子县>长治市城区>沁源县>武乡县>潞城辛安泉；对小鼠淋巴细胞DNA损伤程度为：武乡县>沁源县>长子县>长治市城区>潞城辛安泉。比较结果进一步说明不同淋巴细胞对有机毒物的反应机制可能存在一定的差异性。本次试验5个取水点均为本地区主要城镇居民集中地水源井，其中辛安泉为山西省第二大岩溶泉，是长治市主要的集中式地下水型水源地。根据长治市2015年环境质量公报，按照《地下水质量标准》(GB/T14848—93)Ⅲ类标准评价，辛安泉共监测39个项目，水质达标率100%，符合国家饮用水源地水质要求，其余4个点位也都符合饮用水水质标准。一般来说，深层地下水不易遭受污染，有机物含量极低，然彗星试验中采用的受试物是水体的有机浓集物，实验表明，各水样即使在低剂量组也均能导致细胞DNA损伤，与对照组有显著性差异(P < 0.05或P < 0.01)，提示有机污染物导致水体致突变作用普遍存在，从而为地下水安全预警提供了一种快速、有效的检测方法。

表2 各水样有机浓集物对小鼠淋巴细胞的DNA损伤Table 2 DNA damages in mouse lymphocytes exposed to organic extracts from different water samples

长期以来，我国地下水监测多以无机物指标为主，针对地下水中有机物主要采用一些间接指标和单一理化指标，这些指标难以反映有机污染物对环境和人体的综合危害[18]。鉴于地下水有机污染物含量甚微，更具复杂性和隐蔽性，建立一套完整的短期生物学测试方法，能较好地反映地下水体有机污染的综合毒性，特别是对生物机体的遗传毒性，具有更加现实的重要意义。迫切需要解决的问题是建立遗传毒性检测的标准化体系，以利于提供相对统一的检测依据。

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◆

GenotoxicityEvaluationofOrganicPollutantsinGroundWaterwithCometAssay

Liu Ruixiang1,2,*, Bian Gaopeng1,2, Lan Tingting1, Sun Xueru1, Chang Huili3, Ren Jiahong1,2

1. The Department of Biology Science and Technology, Changzhi College, Changzhi 046011, China2. Taihang Mountain Institute of Ecology and Environment, Changzhi 046011, China3. Environmental Monitoring Station of Changzhi, Changzhi 046000, China

10.7524/AJE.1673-5897.20161117001

2016-11-17录用日期2016-12-17

1673-5897(2017)3-726-06

X171.5

A

刘瑞祥(1964-)，男，教授，主要从事遗传毒理学等方面研究，以第一作者或通讯作者在国内外发表学术论文50余篇。

山西省高等学校大学生创新创业训练重点项目(No.2015426)；地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目(No.201510122001)

刘瑞祥(1964—)，男，汉族，硕士，教授，研究方向为遗传毒理学，E-mail：liuruixiang1964@163.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: liuruixiang1964@163.com

刘瑞祥, 边高鹏, 兰婷婷, 等. 彗星试验检测地下水有机污染物的遗传毒性效应[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 726-731

Liu R X, Bian G P, Lan T T, et al. Genotoxicity evaluation of organic pollutants in ground water with comet assay [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 726-731 (in Chinese)