五氯酚(PCP)对鸡肝癌细胞(LMH)毒性效应的机制研究

蒋鹏，盛南，王建设，戴家银

中国科学院动物研究所中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室，北京 100101

五氯酚(PCP)对鸡肝癌细胞(LMH)毒性效应的机制研究

蒋鹏，盛南，王建设，戴家银*

中国科学院动物研究所中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室，北京 100101

五氯酚(pentachlorophenol, PCP)是一种持久性有机污染物，广泛用于灭钉螺、木材防腐、除草剂等方面，由于PCP在环境中的持久性和生物累积性，其对生态环境和人类健康造成潜在危害。本文以鸡肝癌细胞系(chicken hepatoma cells, LMH)为受试对象，探讨了PCP对细胞色素P450(CYP450)和抗氧化系统的影响。MTT结果显示LMH细胞经不同浓度PCP暴露后，呈现出先促进细胞增殖后抑制的J-型曲线，PCP对LMH细胞24 h的半数效应浓度(24 h-EC50)为427.52 μmol·L-1。LMH细胞在1.56、6.25、25、100 μmol·L-1PCP染毒条件下可增加细胞EROD、MROD、PROD和BFC活性，并可使CYP1A、1B、1C、2H及3A家族基因mRNA表达水平升高。LMH细胞在0.4～100 μmol·L-1PCP染毒下可显著降低硫酸基转移酶(SULT1B1和SULT 1C1)基因mRNA水平。此外，LMH细胞在6.25、25、100 μmol·L-1PCP染毒下可引起细胞内ROS升高，同时PCP(1.56～100 μmol·L-1)可显著增加细胞内MDA含量和降低GSH/GSSH比值。这些结果表明细胞色素P450(CYP450)基因及酶活性的变化、细胞内ROS和MDA含量及GSH/GSSH可作为评价LMH细胞PCP毒性效应的敏感性生物标志物。此研究在细胞水平上利用多个评价指标研究PCP对细胞的毒性效应，为PCP环境风险评价提供依据。

五氯酚；鸡肝癌细胞系；细胞色素P450；硫酸基转移酶；氧化应激

Received12 December 2016accepted10 February 2017

Abstract: Pentachlorophenol (PCP), a persistent organic pollutant, has been used for wood preservation and as a herbicide and insecticide. Due to its persistence in the environment and bioaccumulation, PCP causes potential harm to the ecological environment and human health. In this study, chicken hepatoma cells (LMH) were used to explore the effect of PCP on antioxidant systems and cytochrome P450 (CYP450) levels. The results revealed that 1.56, 6.25, 25 and 100 μmol·L-1PCP could increase EROD, MROD, PROD and BFC levels, and remarkably upregulated the expressions of CYP1A, 1B, 1C, 2H and 3A families. Data obtained from 24 h-exposure studies demonstrated that 0.4-100 μmol·L-1PCP could decrease sulfotransferase (SULT1B1 and SULT 1C1) expression levels. When LMH cells were exposed to 6.25, 25, and 100 μmol·L-1PCP for 24 h, ROS and MDA content increased, while GSH/GSSH deceased significantly. These experimental results showed that PCP exposure could change CYP450 gene expression and activity, ROS and MDA content, and GSH/GSSH ratioin LMH cells. In this view, multiple evaluation indexes should be used to assess the cell toxicity of PCP, which will provide better understanding for PCP risk assessment and mechanism studies.

Keywords: pentachlorophenol; chicken hepatoma cells; cytochrome 450; sulfotransferase; oxidative stress

五氯酚(pentachlorophenol, PCP)作为氯代烃类杀虫剂和灭真菌剂，具有低成本优势，被广泛地用作农业杀虫剂、除草剂和木材防腐剂等[1]。PCP因具有稳定的芳香环结构和高氯含量而不容易被降解，已成为重要的环境污染物[2]，PCP污染所造成的环境问题也日益受到全社会的高度重视[3]。PCP可以通过雨水等扩散，从而转移到水果、蔬菜和谷物中[4]。已有研究表明，PCP在水系统中半衰期长达200 d[5]；PCP在人体内的半衰期为33 h至16 d[6]。PCP对动物体毒性研究表明慢性暴露可造成啮齿类动物多种不良效应，包括免疫系统损伤等[7-10]。PCP是潜在的致癌物质，在实验动物中可诱发肿瘤，其氧化脱氯生成的生物大分子在PCP的毒性中具有重要作用[11]。

流行病学研究显示，职业人群在PCP暴露后增加了患恶性淋巴瘤和白血病的风险[9]。因此开展PCP对生物体的毒理学研究，特别是在细胞水平上利用多个评价指标研究PCP对细胞的毒性效应，对有毒物质的环境风险评价具有重要意义。研究发现PCP可通过解偶联氧化磷酸化产生细胞毒性[12]。生物体细胞中CYP3A4酶承担PCP的生物转化作用，通过产生毒性更强的四氯代氢醌(tetrachlorohydroquinone, TCHQ)而产生细胞毒性[13]。TCHQ是PCP的主要毒性代谢产物，活性氧(ROS)参与了TCHQ的毒性作用。同时PCP的毒性也可能与生成的高反应性代谢物——四氯-1,4-苯醌(tetrachloro-1,4-benzoquinone, TCBQ)有关[14]。作为亲电子分子，TCBQ与脱氧鸟苷形成加合物，从而导致细胞遗传毒性[15]。此外，TCBQ易迅速产生四氯醌(tetrachlorosemiquinone, TCSQ)自由基，并使细胞产生氧化应激。这些研究表明PCP及代谢产物对人和动物细胞具有遗传毒性和潜在的致癌性。鸟类作为生态系统食物链中的顶级生物类群与人类处于相似的食物链地位，已经成为监测生态环境中卤代有机污染物的指示生物[16]，因此本研究开展了PCP对鸡肝癌细胞的毒性效应，并初步探讨了其毒性机制，为评价PCP环境污染水平和对人群的潜在威胁提供理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

PCP(CAS号87-86-5，纯度97%)和Gelatin购自Sigma-Aldrich(美国)；Waymouth’s MB 752/1培养基(货号：11220-035)和进口胎牛血清(货号：10099141)购自Gibco(美国)；H2DCF-DA(Life Technologies，美国)。

1.2 细胞培养

鸡肝癌细胞系(chicken hepatoma cells, LMH)(CRL-2117)购自ATCC公司(美国)。在无菌条件下，用0.1% gelatin溶液包被细胞培养瓶。LMH细胞用Waymouth’s MB 752/1培养基和15%进口胎牛血清于37 ℃、5% CO2培养箱进行培养。

1.3 细胞暴露实验

首先将PCP溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，配成200 mmol·L-1PCP母液[12]。然后用含有血清的培养基将PCP母液稀释成不同的浓度。对照组用含有血清的培养基。将培养瓶中的细胞消化，进行细胞计数，然后在6或96孔板中加入一定的细胞个数。24 h后，可将原有的培养基倒掉，加入含不同PCP浓度的培养基，在培养箱继续培养。

1.4 细胞活力检测(MTT法)

设置96孔板中间6×10阵列共60个孔为实验孔，取100 μL细胞悬液接种于96孔板中，每孔细胞数为3×104。细胞培养4 h后，弃去原有培养基，加入200 μL用培养基稀释成不同浓度的PCP溶液(0～1 mol·L-1设定浓度梯度)，在培养箱继续培养。每组设6个平行孔。

在PCP处理细胞24 h后，每孔中加入20 μL现配制的5 g·L-1MTT溶液，放入CO2细胞培养箱中，继续培养4 h后，弃去培养基，每孔中加入150 μL DMSO，然后在酶标仪中设置程序震荡5 min，选择光吸收模式，在570 nm读取每孔中光吸收值。实验重复3次。计算细胞抑制率：细胞抑制率(%)=(1﹣实验组OD平均值/对照组OD平均值)×100%。

1.5 细胞内活性氧(ROS)的测定

将H2DCF-DA配制成10 mmol·L-1的母液，再用waymouth’s MB 752/1培养基(不含血清)将母液稀释1 000倍，稀释成10 μmol·L-1的工作液。不同浓度PCP处理LMH细胞方法同前，每组设6个平行孔，重复3次。细胞染毒24 h后在96孔板中加入5 μL H2DCF-DA的工作液，37 ℃条件下反应30 min。每孔加入200 μL不含血清的waymouth’s MB 752/1培养基洗涤LMH细胞3次。在每孔中加入100 μL 1×PBS，检测反应生成的DCF荧光。

1.6 实时荧光定量PCR

细胞样品总RNA的提取：6孔板中每孔的LMH细胞约106个，每组设6个平行孔，重复3次。经过不同浓度的PCP暴露后，用TRIzol法提取细胞RNA。

荧光定量PCR检测目的基因用天根公司试剂盒。定量引物在表1中列出。

1.7 细胞P450酶活性和抗氧化指标的检测

细胞染毒方法同前，每组设6个平行孔，实验重复3次。细胞色素P450酶活性(EROD、MROD、PROD、BROD和BFC)用试剂盒(Genmed Scientifics Inc.，美国)检测。MDA含量和GSH/GSSH比值的测定采用南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒。

1.8 数据统计

通过SPSS软件(SPSS, Inc., 美国)进行数据的统计和分析。统计数据用平均值±标准误(mean± SD)表示。使用单因素的方差及最小显著差法(LSD)分析对照组和实验组间的差异，P< 0.05表示差别具有统计学意义。

2 结果(Results)

2.1 LMH细胞经PCP处理后的细胞活力变化

用不同浓度的PCP处理LMH细胞24 h后，计算出各浓度PCP对细胞的抑制率，采用biphasic浓度效应模型拟合[17]，剂量-效应曲线见图1。结果显示LMH细胞经不同浓度PCP暴露24 h后，呈现出先促进细胞增殖后抑制的J-型曲线。MTT实验结果推导出PCP对LMH的24 h-EC50为427.52 μmol·L-1。

表1 鸡肝癌细胞系(LMH)细胞经PCP暴露后荧光定量PCR引物列表Table 1 The primers for genes in chicken hepatoma cells (LMH) exposed to PCP

图1 不同浓度的PCP处理LMH细胞24 h后 细胞活力变化Fig. 1 MTT assay in LMH cells exposed to PCP for 24 h

LMH细胞在0.4～25 μmol·L-1PCP染毒剂量下，细胞活性未受到影响。100 μmol·L-1PCP使细胞活力增加17%(图2)。为了研究在不引起LMH细胞活性受到抑制的情况下，低浓度PCP对细胞内酶活性和抗氧化反应的影响，LMH细胞经0.4、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1PCP处理后测定细

胞内CYP450酶活性等指标。

2.2 PCP处理LMH细胞CYP450及SULT1s基因表达的变化

经不同浓度PCP暴露24 h的LMH细胞，细胞CYP1A4、CYP1A5、CYP1B1、CYP1C1、CYP3A4和CYP3A37基因表达变化见图3。其中，25和100 μmol·L-1PCP可引起LMH细胞内CYP1A4表达量升高，CYP1A5在6.5～100 μmol·L-1PCP浓度下较对照组显著升高，在100 μmol·L-1组升高6.27倍。而CYP1B1基因只在6.5 μmol·L-1PCP暴露组升高，CYP1C1只在25 μmol·L-1PCP暴露组升高。芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AHR)和芳香烃受体核转运蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)在1.56 μmol·L-1PCP浓度暴露下可被诱导。PCP浓度为0.4～100 μmol·L-1可引起细胞中SULT1B1和SULT1B1表达明显下降(图3)。

图2 不同浓度PCP处理LMH细胞24 h后细胞活力变化Fig. 2 The viability of LMH cells treated with different concentration of PCP for 24 h

图3 PCP处理LMH细胞24 h后，CYP450及SULT1B基因表达的变化Fig. 3 Effects of PCP on CYP450 and SULT1B mRNA expression in LMH cells

图4 PCP处理LMH细胞24 h后，CYP450酶活性变化注：乙氧基异酚恶唑脱乙基酶(EROD)，甲氧基异酚恶唑脱甲基酶(MROD)，苄氧基试卤灵-O-脱烷基化酶(BROD)， 戊氧基异酚恶唑脱甲基酶(PROD)，苄氧基三氟甲基香豆素脱烷基化酶(BFC)。Fig. 4 Effects of PCP on the CYP450 enzyme activities of the LMH cellsNote: ethoxyresorufin O-deethylation (EROD), methoxyresorufin O-demethylation (MROD), benzyloxyresorufin O-debenzylation (BROD), pentoxyresorufin O-depentylation (PROD), benzyloxy-trifluoromethyl-coumarin (BFC).

2.3 PCP处理的LMH细胞CYP450酶活性

LMH细胞暴露于PCP 24 h后，发现1.56、6.25、25、100 μmol·L-1PCP可增加细胞EROD、MROD、PROD和BFC活性，而并未引起LMH细胞BROD酶活性的变化(图4)。其中，100 μmol·L-1PCP对LMH细胞中的EROD、MROD和PROD酶活性的促进作用最显著。

2.4 LMH细胞对PCP处理的氧化应激响应

LMH细胞暴露于PCP 24 h后，发现6.25、25、100 μmol·L-1PCP可诱导细胞ROS升高，在100 μmol·L-1PCP作用下，ROS可升高23%。GSH/GSSH在1.56～100 μmol·L-1PCP作用下显著降低，其中100 μmol·L-1PCP可使GSH/GSSH比值下降45%，同时，1.56～100 μmol·L-1PCP可以增加LMH细胞内MDA的含量(图5)。

3 讨论(Discussion)

本研究中PCP对鸡肝癌细胞(LMH)活性影响表现为低浓度0.4～25 μmol·L-1PCP对细胞活性无影响，100 μmol·L-1PCP使LMH细胞增殖，高浓度PCP明显抑制LMH生长。AML12小鼠正常肝细胞经PCP染毒后，MTT结果也显示0～3.87 μg·mL-1PCP促进AML12细胞增殖，7.75～31.0 μg·mL-1PCP对AML12细胞出现明显抑制效应[18]。已有研究结果表明PCP暴露对不同类型细胞的生长影响表现出差异性[19]。本研究中PCP对LMH细胞24 h的半数效应浓度24 h-EC50为427.52 μmol·L-1，而PCP对人肝癌细胞系HepG2(human liver carcinoma cell)细胞24 h-EC50为(23.0 ± 5.6) μg·L-1[20]，PCP对人宫颈癌细胞的24 h-EC50为66.59 mmol·L-1[21]，说明与鸡肝癌细胞相比，人肝癌细胞对PCP更敏感。

细胞色素P450(CYPs)是含有血红素结合位点的蛋白家族。由于它们参与多种内源和外源物质的代谢，在生物体内发挥重要的作用[22]。不同的药物和其他外源化合物对生物体CYPs的表达和酶活性影响不同[23]。在众多CYPs中，CYP1A家族是有机污染物转化中发挥主要作用的亚族[24]。PCP可引起HepG2细胞CYP1A1表达升高[20]，在LMH细胞中也发现25 μmol·L-1和6.5 μmol·L-1PCP可分别诱导CYP1A4和CYP1A5的表达。CYP1A基因通过外源物质与芳香烃受体(AHR)结合进而使芳香烃受体核转运蛋白(ARNT)与特定的DNA识别位点结合而被诱导表达[25]。激活的AHR/ARNT复合物识别位位于基因启动子区的外源性反应元件序列(XRE)，进而调控下游基因表达，如CYP1A1和UGTA1酶等[26]。本研究中PCP可显著诱导LMH细胞中AHR和ARNT的表达，进而通过AHR通路诱导其调控基因CYP1A的表达。已有文献表明PCP在生物体内通过形成二聚物导致四氯二苯-p-二噁英(TCDD)生成，而TCDD可以结合AHR诱导CYP1A[27]。本研究中LMH细胞中CYP1B1和CYP1C1分别在6.25和25 μmol·L-1PCP作用下表达水平升高，说明PCP是CYP1B1和CYP1C1的诱导剂。细胞色素P450单加氧酶3A4(CYP3A4)可代谢多种外源物质，体外暴露实验表明PCP可诱导小鼠肝细胞CYP3A4表达[28]，在LMH细胞中也发现6.25～100 μmol·L-1PCP可诱导CYP3A4表达。由于CYP450对外源物质有解毒作用，CYP450基因表达的改变可减轻有毒物质发挥毒性作用[29]。

图5 PCP处理LMH细胞24 h后其氧化应激反应的测定Fig. 5 Effects of PCP on the ROS of the LMH cells

EROD、MROD、BROD和PROD是重要的CYP450酶，在外源化学品解毒中发挥重要作用[30-31]。目前，对外源性物质的代谢研究中，CYP450基因表达的诱导或抑制已经成为生态毒理学和环境污染生物监测的一个有效手段[32-34]。本研究中1.25 μmol·L-1PCP可使细胞EROD、MROD、PROD和BFC活性增加。这表明PCP可改变不同CYP450的酶活性，CYP450酶活性可成为PCP污染监测的指标之一。这些结果说明虽然低浓度PCP未对细胞活性抑制，但细胞内CYP450活性增加，低浓度PCP可通过激活CYP450酶活性而使细胞免受损伤。

生物体内发生的硫酸化反应与环境污染物、致癌物质、激素等各种内源性和外源性化合物的活化及解毒作用有关[35]。硫酸基转移酶(SULTs)可催化从3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)转移SO3-至亲核受体底物而发挥生物转化作用[36]。大量研究表明PCP是SULTs的抑制剂[37-39]，如小鼠SULT1C1活性可被PCP抑制[40]。SULT1B1与脂质代谢有关，芯片的数据显示，SULT1B1在生长快速的鸡肝组织中比生长慢的鸡肝脏组织中表达量高7倍[41]。已有数据显示鸡SULT1C1酶与小鼠SULT1C1结构类似，表明鸟类及哺乳类硫酸基转移酶在结构和功能上是相似的[42]。本研究中发现0.4～100 μmol·L-1PCP暴露可引起LMH细胞SULT1B1和SULT1C1的表达降低，但在此浓度下细胞活性有增强，说明PCP在细胞内通过硫酸基转移酶发生生物转化，减少了PCP对细胞的毒性作用。

活性氧(ROS)通常是线粒体能量代谢的产物，与细胞生长、细胞信号传导和内环境稳定有关[43]。持续升高的ROS水平是肿瘤发生、肿瘤生长和肿瘤转移的特征现象[44]。LMH细胞经低浓度PCP暴露后可引起细胞内ROS升高，同时引起GSH/GSSG比值下降和MDA含量增加，说明PCP也可引起细胞内氧化应激反应，这与白腰文鸟体内暴露实验的结果一致[45]。

本论文中鸡肝癌细胞(LMH)经6.25～100 μmol·L-1PCP染毒后细胞内ROS及MDA含量升高，进而造成机体发生氧化应激反应，同时PCP影响CYP450基因及激活AHR1表达，表明PCP可通过AHR1与ARNT1通路作用于CYP1A基因。此外，PCP在LMH细胞内还参与硫酸基转移酶的生物转化作用。用离体培养的细胞来评价环境中化学物质的毒性作用，是近年来生物和环境相关领域研究的热点之一。本文从细胞、蛋白质和基因水平上分析了PCP对细胞的毒性作用，对PCP环境风险评价具有重要意义。

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TheToxicityandMechanismofPentachlorophenolExposureonChickenHepatomaCells

Jiang Peng, Sheng Nan, Wang Jianshe, Dai Jiayin*

Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

2016-12-12录用日期2017-2-10

1673-5897(2017)3-373-09

X171.5

A

戴家银(1965—)，男，博士，研究员，主要从事持久性污染物的生态毒理学研究工作，发表学术论文100余篇。

广东省自然科学基金(2015A030312005)

蒋鹏(1981-)，女，博士，研究方向为生态毒理学，E-mail: jiangpeng169@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: daijy@ioz.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20161212001

蒋鹏, 盛南, 王建设, 等. 五氯酚(PCP)对鸡肝癌细胞(LMH)毒性效应的机制研究[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 373-381

Jiang P, Sheng N, Wang J S, et al. The toxicity and mechanism of pentachlorophenol exposure on chicken hepatoma cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 373-381 (in Chinese)