离子液体[BMIm][PF6]增强抗性质粒RP4介导的接合转移基因mRNA的表达水平

汪庆，罗义，崔玉晓，齐丽英，周烁磊，杨光,*

1. 河北工程大学 能源与环境工程学院，河北省水污染控制与水生态修复工程技术研究中心，邯郸 0560382. 环境污染过程与基准教育部重点实验室，南开大学，天津300071

离子液体[BMIm][PF6]增强抗性质粒RP4介导的接合转移基因mRNA的表达水平

汪庆1, 2，罗义2，崔玉晓2，齐丽英1，周烁磊1，杨光1,*

1. 河北工程大学 能源与环境工程学院，河北省水污染控制与水生态修复工程技术研究中心，邯郸 0560382. 环境污染过程与基准教育部重点实验室，南开大学，天津300071

环境中广泛存在的抗生素和抗生素抗性基因会导致很严重的人类健康风险。在我们前期研究中发现，离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])作为环境选择性压力可以促进抗生素抗性基因的水平转移。本研究以E. coli DH5α (RP4) 和同属的E. coli HB101，以及E. coli DH5α (RP4)和跨属的Salmonella enterica之间的纯菌接合转移体系为考察对象，从mRNA基因表达调控水平角度阐明离子液体[BMIm][PF6] (0.001～2.5 g·L-1)影响质粒RP4接合转移的机理。结果表明，离子液体[BMIm][PF6]通过抑制基因korA, korB和trbA的mRNA表达水平来提高接合和跨膜转运基因trbBp和trfAp的表达；增强水平转移基因traF的mRNA表达水平，并通过增强负调控基因kilA和kilB的mRNA表达水平抑制质粒的垂直传递过程；通过抑制基因trbK的mRNA表达水平降低接合转移体系的排斥效果，从而促进质粒RP4的接合转移。该结果有助于为抗生素抗性基因在环境中水平转移扩散的机理研究提供理论依据。

离子液体；抗生素抗性基因；质粒RP4；接合转移；mRNA表达

Received12 January 2017accepted13 March 2017

Abstract: Widespread antibiotic and antibiotic resistance genes (ARGs) can pose serious health risks. In our previous study, an ionic liquid (IL) 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate ([BMIm][PF6]) exerted selective pressure promoting the dissemination of ARGs via horizontal gene transfer. To further investigate the molecular mechanisms of an IL [BMIm][PF6] (0.001-2.5 g·L-1) facilitate the conjugative transfer of ARGs with the mRNA expression levels of conjugative transfer genes, plasmid RP4 conjugative transfer were setup from Escherichia coli DH5α (as the donor) to E. coli HB101 (as the recipient, same species) and Salmonella enterica (as the recipient, across genera). Results of the mRNA expression levels of conjugative transfer genes showed that alleviation of the repression of korA, korB, and trbA genes significantly triggered the expression of trbBp and trfAp, promoting the conjugative transfer of plasmid RP4; Enhanced traF mRNA expression levels for facilitating horizontal transfer and increased kilA and kilB mRNA expression levels for inhibiting the genes responsible for vertical transfer; Inhibited trbK mRNA expression levels for decreasing the entry exclusion phenotype, promoting the conjugative transfer of plasmid RP4. It is helpful to provide theoretical basis for the study of the mechanism of ARGs transfer in the environment.

Keywords: ionic liquid; antibiotic resistance genes; conjugative transfer; plasmid RP4; mRNA expression

抗生素和抗生素抗性基因的广泛存在和传播会引起很严重的环境生态风险[1-2]。环境中残留的抗生素所产生的选择性压力被认为是抗生素抗性基因出现、存在和传播的最主要因素[3]。但是，很多报道发现在从来没有使用过抗生素的环境介质中也检测到了抗性基因的存在[4]。抗生素抗性基因主要通过接合、转化和转导的方式在相同种属或者不同种属的细菌之间发生水平转移，从而导致抗性基因在环境中的传播扩散[5]。除了抗生素对抗性基因的筛选作用外，其他环境选择性压力如重金属、消毒剂、洗涤剂、生物杀灭剂和纳米材料等都可以通过增强水平转移来促进抗生素抗性基因在环境中的传播[5-6]。

离子液体作为一种“环境友好型”溶剂，已经广泛应用于能源[7]、生物技术[8]、化学工程[9]、高分子材料[10]、纳米技术[11]等领域。Pham等[12]综述了离子液体在环境中的毒理、降解、归趋和环境风险，离子液体的环境毒性与离子液体碳链长度和阴、阳离子种类有关。通常，水环境中微生物、水生植物考察浓度在0.001～10 g·L-1(碳链长度在4～10之间)[12-13]。通过在植物、动物、微生物、细胞和分子层面对离子液体毒理的研究发现，离子液体可以通过攻击细胞膜的脂质结构使细胞膜受损伤，导致细胞壁不均匀或改变细胞膜成分[14-15]。细胞膜是细菌同属或跨属之间通过水平转移进行基因交换的重要阻碍[5]。在前期研究工作中，我们初步发现一种离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])作为环境选择性压力，可以促进抗生素抗性基因的水平转移[16]。但离子液体[BMIm][PF6]暴露怎样通过影响接合转移基因mRNA表达水平来达到促进抗生素抗性基因的水平转移的目的还有待进一步深入研究。

在抗性质粒RP4介导的接合转移体系中，主要需要两大调控系统基因[17]：一个是调控供体菌与受体菌接合配对形成系统(Mpf)的基因trbBp，它主要负责供体菌和受体菌细胞的接触和DNA跨膜转运过程[18]。另一个是DNA转移与复制系统(Dtr)的基因trfAp，它主要负责质粒RP4在供体菌细胞内单链的切割， DNA的跨膜转运和单链DNA在受体菌细胞内双链的复制过程[19-20]。这2个基因在调控过程中又都受到负调控因子korA、 korB和trbA基因的控制[21]。另外，质粒RP4的接合转移还受细菌垂直传递(自我复制)基因kilA和kilB的负调控以及水平转移正调控基因traF的影响[22]。在质粒RP4进入受体菌过程中，又会受体细胞进入排斥系统基因trbK的抑制作用[23-24]。

本文主要以E. coli DH5α (RP4) 和同属的E. coli HB101，以及E. coli DH5α (RP4)和跨属的Salmonella enterica之间的纯菌接合转移体系为考察对象，研究离子液体[BMIm][PF6] (0.001～2.5 g·L-1) 对质粒RP4在同属和跨属之间接合转移的影响。并从mRNA基因表达调控水平来阐明离子液体[BMIm][PF6]促进质粒RP4接合转移的机理。本研究有助于为抗生素抗性基因在环境中水平转移扩散的机理研究提供理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试剂与仪器

试剂：离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])购自中国科学院兰州理化研究所(纯度>99.9%)。氨苄青霉素、卡那霉素、盐酸四环素、链霉素购自天津鼎国生物技术公司。

仪器:定量PCR仪(CFX Connect，BIO-RAD)；PCR梯度基因扩增仪(S1000 Thermal，BIO-RAD)；紫外凝胶成像仪(Tanon1600，天能科技有限公司)；电泳仪(DY-A2，上海西巴斯生物技术公司)；恒温培养箱(GNP-9160, 上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 实验质粒和菌株

(1)质粒RP4：实验中的质粒RP4由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所李君文研究员馈赠。该质粒同时携带有氨苄青霉素、卡那霉素和四环素的3种抗生素抗性(ApR, KmR和TcR)，能够在多个细菌种属间进行水平转移。使用前保存于-80 ℃冰箱。

(2)含质粒RP4的细菌E. coli DH5α：通过转化将质粒RP4转入感受态的E.coli DH5α中，从而使E. coli DH5α同时携带有氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素3种抗性。

(3)细菌E. coli HB101为实验室保藏所有。Salmonella enterica为前期实验筛选获得的环境土著菌。2种菌都携带链霉素抗性(StrR)。

1.3 实验方法

1.3.1 建立质粒RP4纯菌接合转移体系

利用接合转移实验考察离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6]) 对质粒RP4从供体E. coli DH5α(ApR, KmR和TcR)分别向受体E. coli HB101 (StrR,同属接合转移) 和受体Salmonella enterica(StrR, 跨属接合转移)的影响。供体菌(E. coliDH5α)和受体菌(E. coli HB101和Salmonella enterica)分别过夜培养后，菌液经离心后调整菌液浓度至OD600≈0.400(对应的菌液浓度为108cfu·mL-1)。供体菌和受体菌中各加入0.5 mL，混合均匀，并添加离子液体[BMIm][PF6]使其最终浓度为0, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5和 2.5 g·L-1，每个浓度设置3组平行。

水平转移体系置于30 ℃的恒温培养箱中静置进行。实验结束后，利用10倍梯度稀释法将接合液涂布到LB固体选择性培养基(100 mg·L-1Ap, 60 mg·L-1Km, 10 mg·L-1Tc，30 mg·L-1Str)筛选接合子。接合子(NT, ApR, KmR, TcR和StrR) 用4种抗性的固体培养基筛选，并以平板上生长的每毫升菌落数(cfu·mL-1)进行计数；受体菌(NS, StrR) 用链霉素抗性(30 mg·L-1Str)固体培养基筛选，并以平板上生长的每毫升菌落数(cfu·mL-1)进行计数。接合转移频率为接合子与受体菌数量的比值，计算公式为: f = NT(cfu·mL-1)/NS(cfu·mL-1)。

表1 目标基因PCR引物和PCR条件Table 1 PCR primers and PCR conditions

注：FW是前引物， RV是后引物。

Note: FW, forward; RV, reverse.

同时，作为阴性对照，供体菌(E. coli DH5α)和受体菌(E. coli HB101和Salmonella enterica)也分别涂布到含4种抗性的LB固体培养基(100 mg·L-1Ap, 60 mg·L-1Km, 10 mg·L-1Tc，30 mg·L-1Str)上，以排除自发突变产生的具有4种抗性的假接合子。

1.3.2 接合体系RNA的提取

取上述接合菌液，4 ℃下离心收集菌体用于RNA提取。细菌RNA利用Takara的细菌RNA提取试剂盒进行。利用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，采用TaKaRa第一链cDNA合成试剂盒，反转录合成cDNA第一链，逆转录的反应体系和反应条件均参考试剂盒的操作说明。

1.3.3 荧光定量PCR检测mRNA的表达

检测mRNA表达的目的基因为: (1) 调控质粒RP4配对和转移复制的调控基因trfAp和trbBp，以及3个相应的全调控因子基因korA、 korB 和trbA; (2) 影响质粒RP4接合转移的基因traF、 kilA和kilB；(3) 进入阻碍体系基因trbK。所有基因的引物是根据有关文献的报道或根据Genebank中该基因的全序列，利用DNAStar的PrimerSdecte程序进行设计。所有基因的引物序列及扩增产物片段长度见表1。

荧光定量PCR方法及体系、标准曲线的制备和基因表达量的计算参考文献[25-26]。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 20.0对数据进行统计分析。实验组和对照组数据进行 One way ANOVA检验差异性分析，并利用Student-Newman-Keuls (S-N-K) 检验，P< 0.05 (*)、P< 0.01(**)为具有显著性差异。

2 结果与讨论 (Results and discussion)

2.1 离子液体[BMIm][PF6]对质粒RP4接合转移的影响

同属和跨属接合转移体系中，离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])都能促进质粒RP4的接合转移(图1)。接合转移频率随离子液体[BMIm][PF6]浓度的增加而增加(0.001～0.5 g·L-1)，在同属的从E. coli DH5α到E. coli HB101接合转移中，0.5 g·L-1[BMIm][PF6] [(1.82±0.38)×10-3]的接合频率是对照组[(2.07±0.62)×10-5]的80倍。另外，离子液体[BMIm][PF6]同样促进跨属的从E. coli DH5α到Salmonella enterica的接合转移，并且接合转移频率随离子液体[BMIm][PF6]浓度的增加而增加(0.001～0.5 g·L-1)，在浓度0.5 g·L-1[(5.27±0.14)×10-5]时达到最大值，约为对照组[(3.33±0.67)×10-6]的16倍(图1)。

相反，与0.5 g·L-1离子液体[BMIm][PF6]浓度相比，在离子液体[BMIm][PF6]最高的实验浓度2.5 g·L-1时，接合转移频率开始降低(图1)。这可能是因为在高浓度(2.5 g·L-1)时，高浓度[BMIm][PF6]对细菌的毒理效应使体系中供体菌和受体菌的浓度过低。同属和跨属两组接合转移体系中，供体菌、受体菌和接合转化子在浓度0～2.5 g·L-1离子液体[BMIm][PF6]范围内生存率可以看出，浓度在0～0.5 g·L-1时，体系中供体菌和受体菌数量基本没变化，而在2.5 g·L-1高浓度时，供体菌存活率只有对照组的19.65%，受体菌存活率也只有对照组的19.90% (数据未列出)。邱志刚等[27]也报道过同样的研究结果，在纳米材料影响的接合转移中，高浓度的纳米材料使接合转移频率降低也是由于在高浓度的纳米下，供体菌和受体菌的存活率过低。供体菌和受体菌的菌液浓度是接合转移过程中的极其重要的因素，过低的菌液浓度会直接导致接合转移转移中细菌与细菌接触的机会，从而导致接合转移的频率过低。

同时，研究结果还发现质粒RP4在E. coli DH5α和E. coli HB101同属之间的接合转移明显要高于在E. coli DH5α和Salmonella enterica跨属之间的接合转移(P<0.05, S-N-K 检验)。

图1 离子液体[BMIm][PF6]浓度对质粒RP4分别 从E. coli DH5α到E. coli HB101和从E. coli DH5α到 Salmonella enterica接合转移的影响注：接合转移条件为pH 7.0, 温度30 ℃, 接合时间12 h。Fig. 1 The conjugation of plasmid RP4 from E. coli DH5α to E. coli HB101 and from E. coli DH5α to Salmonella enterica was affected by [BMIm][PF6] concentration mated for 12 h at pH 7.0 and 30 ℃.

本文报道的离子液体[BMIm][PF6]促进抗生素抗性基因增强的效果低于0.5 g·L-1纳米氧化铝的效果，0.5 g·L-1纳米氧化铝使质粒RP4从 Escherichia coli到Salmonella spp.的水平转移频率比空白对照组高200倍[27]，但是0.5 g·L-1[BMIm][PF6]的促进效果要高于0.16 g·L-1VCl3的促进效果。Ganske等[28]报道了0.16 g·L-1VCl3使Photobacterium到Escherichia coli的水平转移频率比空白对照组高2倍。本文中离子液体[BMIm][PF6]的暴露浓度比文献[29]报道的浓度低3～8倍，在这些高于本文浓度的离子液体暴露下，对Escherichia coli只表现出轻微抑制作用，并且对酵母Saccharomyces cerevisiae和细菌Pichia pastoris、Bacillus cereus的细胞生存能力没有影响[30]。

通过水平转移产生的获得性抗性在抗生素抗性基因从外来菌向土著菌群的转移和传播过程中起着非常重要的作用[31-32]。在微生物面临的众多新的环境选择性压力时，抗生素、重金属、异性生物质、杀虫剂、洗涤剂和有机溶剂等都对抗生素抗性基因起着很强的环境选择性[6]。在本文中，离子液体作为一种选择性压力促进抗生素抗性基因在细菌间中的水平转移，从而导致抗性基因在环境介质中的传播扩散。尤其值得注意的是，和抗生素不同，离子液体在环境介质中不容易降解，会作为一种持续存在的环境选择性压力，长期起到促进抗性基因水平转移的作用，从而增强离子液体这一新型环境污染物的环境生态风险。

2.2 离子液体[BMIm][PF6]对全调控基因表达的影响

接合转移受控于供体菌和受体菌之间接合桥的形成，该过程受到杂交对形成系统基因trbBp和质粒转移复制基因系统基因trfAp的控制[18-20]。它们分别调控质粒RP4的接合和跨膜转运过程。有文献研究了在离子液体(1-ethyl-3-methylimidazolium chloride)暴露下，细菌Enterobacter lignolyticus转运蛋白和药物外排基因上调，但是离子液体暴露下，接合转移基因的表达调控还未见报道。在本文中，我们首次研究了离子液体[BMIm][PF6]通过调节接合基因的表达调控来增强质粒的接合转移。与空白对照组(0 g·L-1[BMIm][PF6])相比，基因trbBp的mRNA表达水平均明显升高，0.5 g·L-1[BMIm][PF6]中基因trbBp的表达水平最高，同属E. coli HB101中[(1.33±0.06)×10-4/16S rRNA]和跨属Salmonella enterica [(9.18±0.86)×10-5/16S rRNA]中分别是空白对照组的18倍和12倍(图2)。同样，基因trfAp的 mRNA表达水平在同属和跨属中都随离子液体浓度的增加而升高(图2)，这将有助于质粒RP4的转移和复制，促进抗生素抗性基因在环境介质中的传播扩散。

离子液体[BMIm][PF6]抑制全调控基因korA、 korB和trbA的表达。与空白对照组(0 g·L-1[BMIm][PF6])相比，在同属和跨属中，全调控基因korA、 korB和trbA的表达水平都随着离子液体[BMIm][PF6]浓度的升高而明显降低(0.001～0.5 g·L-1)(图3)。基因korA和korB共同抑制trfAp, 而基因korB和trbA共同抑制trbBp。离子液体[BMIm][PF6]通过抑制korA和korB的mRNA表达使trfAp的表达上调; 同时，通过抑制korB和trbA的mRNA表达使trbBp的表达上调。离子液体[BMIm][PF6]通过抑制基因korA、 korB和trbA的表达来提高接合和跨膜转运基因的表达，从而促进质粒RP4的接合转移。

图2 离子液体[BMIm][PF6]对细菌同属和跨属接合转移中调控基因trbBp和跨膜转运复制基因trfAp mRNA表达水平的影响Fig. 2 The mRNA expression levels of regulatory genes trbBp and transfer and replication gene trfAp of the plasmid RP4 in E. coli DH5α to E. coli HB101 and E. coli DH5α to Salmonella enterica transfers was affected by [BMIm][PF6] concentration

2.3 离子液体[BMIm][PF6]对水平转移基因表达的影响

抗生素抗性基因的传播主要通过细菌菌落的垂直传递(自我复制)和水平转移2种途径[5]。基因traF对水平转移过程具有正调控作用，而基因kilA和kilB对垂直传递过程具有负调控作用[22]。在本文中，我们发现离子液体[BMIm][PF6]增强水平转移基因的表达并抑制质粒的垂直传递过程。与空白对照组(0 g·L-1[BMIm][PF6])相比，在同属和跨属中，基因traF的表达水平都显著升高。在0.5 g·L-1[BMIm][PF6]实验组，同属E. coli HB101中基因traF的表达水平是对照组的80倍，跨属Salmonella enterica中基因traF的表达水平是对照组的65倍(图4)。同时，接合转移频率与基因traF的mRNA表达水平在同属(图5 a)和跨属(图5 b)接合转移体系中都具有很好的正相关性。由此可见，同属E. coli HB101和跨属Salmonella enterica接合转移中增强的基因trbK的mRNA表达有助于促进体系中质粒RP4的接合转移。

高浓度(2.5 g·L-1)的离子液体[BMIm][PF6]抑制细菌的存活率。在本文中，kilA和kilB的mRNA 表达水平随离子液体浓度的升高而升高(图4)，说明离子液体[BMIm][PF6]使基因kilA和kilB对垂直传递的负调控作用随浓度增加而增强。这也很好地解释了离子液体通过抑制细菌生长来减少质粒RP4的垂直传递。

2.4 离子液体[BMIm][PF6]对外组排基因表达的影响

进入排斥体系是受体菌对供体质粒进入受体菌过程的阻碍作用。基因trbK主要调控质粒RP4的进入排斥过程[23-24]。基因trbK的mRNA表达水平随着离子液体[BMIm][PF6]浓度的增加而显著降低(0.001～0.5 g·L-1)。在同属的E. coli HB101接合转移中，对照组基因trbK的mRNA表达水平比0.5 g·L-1[BMIm][PF6] [(1.68±0.32)×10-6/16S rRNA]高94倍，但是，在跨属的Salmonella enterica接合转移中对照组基因trbK的mRNA表达水平仅仅比0.5 g·L-1[BMIm][PF6] [(1.81±0.09)×10-4/16S rRNA]高5倍(图6 a)。同时，接合转移频率与基因trbK的mRNA表达水平在同属(图6 b)和跨属(图6 c)接合转移体系中都具有很好的负相关性。由此可见，同属的E. coli HB101接合转移中基因trbK的mRNA过低表达是同属的接合转移频率比跨属的接合转移频率高的主要原因。

图4 离子液体[BMIm][PF6]对细菌同属和跨属接合转移中接合基因traF , kilA , kilB mRNA表达水平的影响Fig. 4 The mRNA expression levels of conjugative genes traF , kilA , kilB of the plasmid RP4 in E. coli DH5α to E. coli HB101 and E. coli DH5α to Salmonella enterica transfers was affected by [BMIm][PF6] concentration

图5 离子液体[BMIm][PF6]对细菌同属(a)和跨属(b)接合转移的转移频率与基因traF相对含量的相关性Fig. 5 Correlation between the transfer frequency versus relative abundance of traF gene of the plasmid RP4 in E. coli DH5α to E. coli HB101(a) and E. coli DH5α to Salmonella enterica transfers (b) was affected by [BMIm][PF6] concentration

图6 离子液体[BMIm][PF6]对细菌同属和跨属接合转移中进入排斥体系基因trbK mRNA表达水平的影响(a)； 离子液体[BMIm][PF6]对细菌同属(b)和跨属(c)接合转移的转移频率与基因trbK相对含量的相关性Fig. 6 The mRNA expression levels of entry exclusion system gene trbK of the plasmid RP4 in E. coli DH5α to E. coli HB101 and E. coli DH5α to Salmonella enterica transfers was affected by [BMIm][PF6] concentration (a); Correlation between the transfer frequency versus relative abundance of trbK gene of the plasmid RP4 in E. coli DH5α to E. coli HB101 (b) and E. coli DH5α to Salmonella enterica (c) transfers was affected by [BMIm][PF6] concentration

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◆

AnIonicLiquid[BMIm][PF6]EnhancedthemRNAExpressionLevelsofConjugativeTransferGenesMediatedbyPlasmidRP4

Wang Qing1, 2, Luo Yi2, Cui Yuxiao2, Qi Liying1, Zhou Shuolei1, Yang Guang1,*

1. College of Energy and Environmental Engineering, Hebei Engineering Research Center for Water Pollution Control and Water Ecological Remediation, Hebei University of Engineering, Handan 056038, China2. Ministry of Education Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Nankai University, Tianjin 300071, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170112006汪庆, 罗义, 崔玉晓, 等. 离子液体[BMIm][PF6]增强抗性质粒RP4介导的接合转移基因mRNA的表达水平[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 273-281

2017-01-12录用日期2017-03-13

1673-5897(2017)3-273-09

X171.5

A

杨光(1987-)，男，环境科学博士，讲师，主要研究方向为环境生态学。

国家自然科学基金 (41473085)；环境污染过程与基准教育部重点实验室开放基金(KL-PPEC-2016-1)；河北省自然科学基金(No. D2017402109)；河北省教育厅青年基金(No. QN2017035)；邯郸市科技计划项目(1621212047)

汪庆(1985-)，男，讲师，研究方向为环境生态毒理学，E-mail: wangqing@hebeu.edu.cn

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: yang87537@hebeu.edu.cn

Wang Q, Luo Y, Cui Y X, et al. An ionic liquid [BMIm][PF6] enhanced the mRNA expression levels of conjugative transfer genes mediated by plasmid RP4 [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 273-281 (in Chinese)