支气管哮喘患者eotaxin-3基因多态性对吸入糖皮质激素的影响*

熊晓琦，宋新宇，曾凡军，孟丽霞，阮玉姝，李文新

(三峡大学第一临床医学院/湖北省宜昌市中心医院呼吸内科 443003)

支气管哮喘患者eotaxin-3基因多态性对吸入糖皮质激素的影响*

熊晓琦，宋新宇△，曾凡军，孟丽霞，阮玉姝，李文新

(三峡大学第一临床医学院/湖北省宜昌市中心医院呼吸内科 443003)

目的探讨eotaxin-3单核苷酸多态性(SNP)对吸入糖皮质激素(ICS)治疗效果的影响，为eotaxin-3作为支气管哮喘治疗靶点提供临床依据。方法收集哮喘患者(n=196)及对照者(n=196)的外周血标本，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测eotaxin-3 +2497T>G ，+77C>T各种基因型，比较各种基因型的哮喘患者对ICS治疗的反应性和ACT评分的变化情况。结果哮喘患者为+2497位TG基因型时，外周血嗜酸性粒细胞(EOS)计数、诱导痰EOS比例和外周血总IgE与TT型相比均明显下降，且差异有统计学意义(P<0.05)，TG型哮喘患者的第1秒用力呼气容积下降20%所需的最低累积剂量(PD20)水平[(0.07±0.03)mg]明显高于TT型[(0.03±0.01)mg]，差异具有统计学意义(t=2.45，P=0.048)；而上述指标在+77位3种基因型间的差异均无统计学意义。+2497位TT型哮喘患者在ICS治疗过程中，第1秒用力呼气量、PD20值和ACT评分均较TG型哮喘患者明显改善，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论+2497位TT型哮喘患者对ICS治疗更敏感，规律ICS治疗能显著改善该类患者的肺功能和临床症状评分。

哮喘；eotaxin-3；单核苷酸多态性；吸入糖皮质激素

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。目前认为嗜酸性粒细胞(EOS)是哮喘气道炎症发生的主要效应细胞[1]。EOS趋化因子eotaxin因对EOS有很强的选择趋化性而得名，eotaxin只与CC趋化因子受体3(CC chemokine receptor3,CCR3)特异性地结合，eotaxin释放后通过作用于EOS上高表达的CCR3受体，不仅能诱导EOS向肺内迁移， 而且也能活化EOS使之脱颗粒释放活性物质，对气道和肺组织造成损伤[2]。

近年来有研究表明，不是所有的哮喘患者气道局部都是以EOS为主的慢性炎症，临床上发现部分哮喘患者对吸入糖皮质激素(ICS)的治疗效果欠佳，而气道以EOS浸润为主的哮喘患者对激素治疗反应更好[3]。目前有研究发现eotaxin的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与EOS的募集和血浆总IgE 水平有关[4]，因此eotaxin基因多态性可能通过影响哮喘患者气道局部EOS的聚集从而影响其对ICS的敏感性。因此，本课题拟检测与EOS的募集、维持更为密切的eotaxin-3的SNP(2497T>G,77C>T)，并观察eotaxin-3+2497T>G，+77C>T不同基因型的支气管哮喘患者对ICS治疗的反应性和临床症状改善情况，为eotaxin-3作为哮喘治疗靶点提供临床参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 2014年1月至2015年12月在本院就诊的196例哮喘患者作为哮喘组，其中男92例，女104例，平均(43.21±10.68)岁。196例健康体检者作为对照组，其中男90例，女106例，平均年龄(45.32±13.35)岁。

表1 PCR-RFLP各项参数设定

1.2入组及排除标准 年龄18～60岁，符合GINA诊断标准的患者为哮喘组，排除有吸烟史、糖皮质激素治疗史、肺部有实质性病变及近4周有上呼吸道感染病史者。无明显呼吸系统疾病者作为对照组，所有入组患者均签署知情同意书。

1.3标本的采集及肺功能测试 采集血浆及诱导氮，受试者进行肺功能检测后，当第1秒用力呼气量(FEV1)/肺活量(FVC)为50%～80%时，给予支气管激动剂乙酰甲胆碱吸入(累计最大剂量2.505 mg)，2 min后重复进行肺功能检测，当FEV1下降20%时，记录乙酰甲胆碱的用量，即第1秒用力呼气容积下降20%所需的最低累积剂量(PD20)值。

1.4方法 利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测eotaxin-3基因SNP：(1)用苯酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA。(2)合成eotaxin-3基因+2497位及+77位引物，PCR扩增目的基因片段，PCR产物经内切酶Eco105Ⅰ酶切(表1)。(3)酶切产物经4%琼脂糖凝胶电泳分离，全自动数码凝胶成像仪扫描分析结果。采用全自动血细胞计数仪测量EOS，用化学发光法测定IgE，仪器为瑞士罗氏 Cobas 601 全自动化学发光分析仪，均由本院检验科完成。

1.5临床症状评估 所有哮喘患者在初诊、ICS(布地奈德)治疗第4周和第8周3个阶段共进行3次ACT问卷评分。

2 结 果

2.1eotaxin-3 +2497位哮喘患者TT、TG基因型的临床特征 经χ2检验，eotaxin-3 +2497和+77在对照组和哮喘组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。+2497位TT型和TG型哮喘患者在年龄、性别、体质量指数、发病年龄和病程方面比较均无明显差异，肺功能方面TG型哮喘患者的PD20水平[(0.07±0.03)mg]明显高于TT型[(0.03±0.01)mg]，差异具有统计学意义(t=2.45，P=0.048)，而两组FEV1%预计值比较无明显差异(表2，图1)。哮喘患者为+2497位TG基因型时，外周血EOS计数、诱导痰EOS比例和外周血总IgE与TT型相比均明显下降，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，图2。

表2 eotaxin-3 +2497T>G各种基因型哮喘患者的临床特征

续表2 eotaxin-3 +2497T>G各种基因型哮喘患者的临床特征

图1 eotaxin-3+2497位TT型和TG型与对照组的FEV1%预计值比较

图2 eotaxin-3 +2497位TT型和TG型哮喘患者诱导痰中EOS%比较

2.2eotaxin-3+2497位TT型和TG型支气管哮喘患者对ICS治疗的反应性 经过4周和8周的吸入布地奈德治疗后，TT型哮喘患者FEV1[ΔFEV1第4周=(0.37±0.13)L；ΔFEV1第8周=(0.35±0.11)L]和PD20值的增加量[ΔPD20第4周=[(0.58±0.22)mg；ΔPD20第8周=(0.53±0.18)mg]明显升高，而TG型哮喘患者在治疗第4周和第8周时，FEV1[ΔFEV1第4周=(0.13±0.03)L；ΔFEV1第8周=(0.11±0.07)L]和PD20值的变化[ΔPD20第4周=[(0.04±0.02)mg；ΔPD20第8周=(0.03±0.01)mg]均不显著，且两组间的差异有统计学意义(均P<0.01)，见表3、图3。

表3 eotaxin-3 +2497位TT型和TG型支气管哮喘患者ICS治疗后肺功能改善情况

A:FEV1；B：PB20；**：P<0.01， 与TG型比较

图3 eotaxin-3+2497位TT型和TG型支气管哮喘患者ICS治疗第4周和8周FEV1和PD20的变化

2.3eotaxin-3 +2497位TT型和TG型支气管哮喘患者治疗前后临床症状的评估 TT型哮喘患者在布地奈德吸入治疗第4周、8周临床症状(包括喘息、呼吸困难和夜间发作次数)得到明显改善，ACT评分较TG型哮喘患者明显改善，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

**：P<0.05，与TG型比较

图4 eotaxin-3 +2497位TT型和TG型哮喘患者ICS治疗第4周和8周ACT评分的变化

3 讨 论

eotaxin 在支气管哮喘的发病过程中起着重要作用，其影响EOS的黏附、募集和脱颗粒，血清中eotaxin的表达水平与哮喘的急性发作及临床症状严重程度相关[5]。eotaxin-3属于eotaxin基因家族亚家族成员之一，此外还包括：eotaxin-l和eotaxin-2，而人类eotaxin-3成熟体由77个氨基酸构成，eotaxin-3是一种与eotaxin-1、eotaxin-2结构不同，但功能相似的EOS趋化因子，在体外eotaxin-3对EOS具有趋化作用及引起细胞内Ca2+浓度快速、短暂升高。之前已有文献报道哮喘患者支气管黏膜eotaxin-3 mRNA表达是明显增高的[6]。近年来国内外已研究的哮喘患者eotaxin SNP有eotaxin-1：67G>A，1820A>C，1834T>G，1384G>A，576C>T， 384A>G，426C>T；eotaxin-2： 96G>A，179T>C ，275C>T，304A>C，1923C>A，1926G>A；eotaxin-3：77C>T，2497T>G等位点[7]。eotaxin-3位于7q11.23染色体上，共有3个外显子，目前已经发现有7个SNP位点，其中有5个位于内含子区域，一个位于5′-非编码区，另一个位于3′-非编码区[8]。本文研究的eotaxin-3 +2497和+77分别位于3′-非编码区和内含子区域。

之前国内有研究发现，eotaxin-3 +2497T>G多态性与哮喘易感性、外周血EOS数量、IgE水平相关，+77C>T基因多态性与哮喘患者外周血EOS数量有关。而Chae等[9]在对eotaxin基因家族基因多态性与哮喘关系的研究中发现eotaxin-3 +2497位点可能在EOS的募集和血浆总IgE水平的维持中起重要作用。这与本文笔者对eotaxin-3 +2497T>G多态性的研究结果一致，而+77C>T基因多态性笔者并未发现与上述指标的相关性。外周血总IgE水平能用于评估哮喘患者的过敏状态，eotaxin-3 +2497位TT型哮喘患者外周血总IgE水平明显高于TG型哮喘患者，说明TT型哮喘患者对过敏原的敏感性高，更容易致敏。

在此基础上为了进一步探索eotaxin-3不同基因型支气管哮喘患者对ICS治疗的反应性，笔者对eotaxin-3 +2497位的TG型和TT型支气管哮喘患者进行了吸入糖皮质激素反应试验比较，通过检测两种基因型支气管哮喘患者在吸入布地奈德治疗8周过程中肺功能指标FEV1和PD20值的变化情况，探讨支气管哮喘eotaxin-3 +2497位TT型和TG型与ICS治疗的不同反应性之间的关系。本研究结果发现TT型哮喘患者在ICS治疗后，肺功能FEV1和PD20值的增加量(ΔFEV1和ΔPD20)明显升高，肺功能得到改善，而TG型哮喘患者的ΔFEV1和ΔPD20值并无明显改善。这表明eotaxin-3 +2497位TT型哮喘患者对ICS治疗的反应性更敏感，而这可能与TT型哮喘患者更易引起EOS聚集从而导致气道以EOS浸润为主有关，因此规律的ICS治疗能显著降低TT型哮喘患者的气道高反应性，改善肺功能。

同时笔者还对两种基因型哮喘患者治疗前后临床症状进行了评估，发现TT型哮喘患者在布地奈德吸入治疗第4周、8周ACT评分较TG型哮喘患者明显改善，这部分患者的临床症状改善情况与其肺功能改善情况一致，从而进一步证实eotaxin-3 +2497位TT型哮喘患者进行规律的ICS治疗能控制其哮喘发作频率和改善肺功能。

综上所述，本研究证实，eotaxin-3 +2497 TT型哮喘患者的发病基础可能与外周血EOS的增多和气道EOS局部浸润有关，此型哮喘患者对ICS的治疗更敏感，规律的ICS治疗能显著降低此型哮喘患者气道高反应性，改善肺功能和临床症状。

[1]Ahmadi Z,Hassanshahi G,Khorramdelazad H,et al.An overlook to the characteristics and roles played by eotaxin network in the pathophysiology of food allergies:allergic asthma and atopic dermatitis[J].Inflammation,2016,39(3):1253-1267.

[2]Borish L.The immunology of asthma:asthma phenotypes and their implications for personalized treatment[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2016,117(2):108-114.

[3]BlanchardC.Molecularpathogenesisof心脏病患者跨室壁复极离散度心电学检测及临床意义[J]．中华老年心脑血管病杂志，2015，17(1)：40-44．

[9]李立军，罗燕，秦辉．慢性心衰病程变化与心电图ST-T改变的相关性研究[J]．当代医学，2015，21(2)：78-79．

[10]赵红敏，刘丽娜，王亦文，等．T波峰末间期在急性心肌梗死预后评估中的价值[J]．中国老年学杂志，2014，34(20)：5660-5661．

[11]Medina RA,Lankipalli RS,Yan GΧ,et al.Effect of epicardial or biven-tricular pacing to prolong QT interval and increase transmural dispersion of repolarization:does resynchronization therapy pose a risk for patients predisposed to long QT or torsade de points[J].Circulation,2013,107(5):740-746.

Impactofeotaxin-3genepolymorphismsoninhaledcorticosteroidsinpatientswithbronchialasthma*

XiongXiaoqi,SongXinyu△,ZengFanjun,MengLixia,RanYushu,LiWenxin

(DepartmentofRespiration,FirstClinicalCollegeofThreeGorgesUniversity/YichangMunicipalCentralPeople′sHospital,Yichang,Hubei443003,China)

ObjectiveTo investigate the impact of eotaxin-3 gene polymorphisms on the clinical effect of inhaled corticosteroids (ICS) to provide clinical basis for eotaxin-3 as the target spot for treating bronchial asthma.MethodsOne hundred and ninety-six cases of asthma and 196 cases as controls were selected from the outpatients and inpatients in our hospital.Peripheral blood samples were collected from the asthma patients and normal controls.PCR-RFLP was adopted to detect the genotypes of eotaxin-3 +2497T>G and +77C>T.The response of ICS treatment and the change situation of ACT scores were compared among asthmatic patients with various genotypes.ResultsPeripheral blood eosinophil(EOS) counts,EOS proportion and total IgE in the patients with TG genotype at+2497 locus were significantly decreased compared with those in the patients with TT genotype,the difference was statistically significant(P<0.05).The level of PD20 in asthmatic patients with TG genotype was significantly higher than that in the patients with TT genotype,the difference was statistically significant[(0.07±0.03)mgvs. (0.03±0.01)mg,t=2.45，P=0.048];whereas the above indicators had no statistical difference among 3 kinds of +77 genotypes.During ICS treatment process in the patients with TT genotype at +2497 locus,the FEV1%,PD20 value and ACT scores were significantly improved compared with those in the patients with TG genotype,the difference was statistically significant(P<0.01).ConclusionThe asthmatic patients with TT genotype at +2497 locus were more sensitive to ICS treatment,regular ICS treatment can significantly improve the lung function and clinical symptom score in these patients.

asthma；eotaxin-3；single nucleotide polymorphism；inhaled corticosteroids

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.013

R256.12

A

1671-8348(2017)27-3786-03

2016-11-06

2017-05-24)

湖北省教育厅科研计划项目(B2015254)。

熊晓琦(1975-)，硕士，副主任医师，主要从事慢性气道疾病、肺癌方面的研究。△

，E-mail:songxinyuhxk@126.com。