N-乙酰-L-色氨酸对大鼠肝脏缺血再灌注后肠损伤的保护作用*

王淑惠，姜红心，李晓双，胡梦琪，于 海，张 明，于树娜，王健欣，蒋吉英△

(1.潍坊医学院临床医学院2013级17班,山东潍坊 261053；2.潍坊医学院人体解剖学教研室,山东潍坊 261053；3.潍坊医学院临床医学院2013级7班,山东潍坊 261053)

N-乙酰-L-色氨酸对大鼠肝脏缺血再灌注后肠损伤的保护作用*

王淑惠1，姜红心2，李晓双2，胡梦琪3，于 海2，张 明2，于树娜2，王健欣2，蒋吉英2△

(1.潍坊医学院临床医学院2013级17班,山东潍坊 261053；2.潍坊医学院人体解剖学教研室,山东潍坊 261053；3.潍坊医学院临床医学院2013级7班,山东潍坊 261053)

目的探讨N-乙酰-L-色氨酸(L-NAT)对大鼠肝脏缺血再灌注中肠损伤的保护作用。方法将健康成年雄性SD大鼠24只分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)和缺血再灌注加L-NAT组(IR+L-NAT组)。用夹闭肝中叶和左叶肝蒂分支的方法制作肝缺血再灌注模型，用苏木素-伊红(HE)染色法观察小肠组织的形态学结构,用免疫组织化学染色观察激活型Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达。结果(1)IR组小肠绒毛结构破坏，肠黏膜充血脱落,上皮细胞变性坏死，出现炎症细胞浸润；L-NAT可使之减轻。(2)免疫组织化学染色显示，与Sham组相比，IR组激活型Caspase-3、Bcl-2和bax的表达升高，L-NAT干预后，Caspase-3和Bax的表达下降，而Bcl-2的表达进一步升高。结论L-NAT可抑制肝脏缺血再灌注损伤引起的小肠上皮细胞凋亡，减轻小肠上皮细胞损伤。

缺血再灌注损伤;小肠;N-乙酰-L-色氨酸;细胞凋亡;大鼠

在近代肝脏外科手术中，肠道损伤是常见的病理生理现象,手术中肝门阻断可造成门静脉淤血致肠黏膜屏障破坏,肠黏膜通透性增高,引发肠内毒素及菌群移位,加重肝脏缺血再灌注损伤，形成恶性循环[1-2]，从而影响手术的成功率和患者的存活率。有研究发现,P物质(substance P,SP)通过SP/NK-1系统参与了心、脑、肝、胰腺、肺、结肠等多种内脏器官的氧化应激损伤[3-7]。N-乙酰-L-色氨酸(N-acetyl-L-tryptophan,L-NAT)具有拮抗NK-1受体的作用[8],但对肝脏缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)后小肠上皮细胞损伤的保护作用尚未见报道。本研究通过建立肝脏IR模型,探讨L-NAT对肠损伤的保护作用，为开发治疗肝脏IR后肠损伤的新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物的分组、动物模型的制备和药物预处理 健康成年雄性SD大鼠24只，购自山东鲁抗制药有限公司，体质量200～250 g。分为假手术组(Sham组)、IR组、IR加L-NAT组(IR+L-NAT组)，每组8只。实验动物术前禁食12 h，自由饮水。用1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，上腹部正中切口，游离肝门血管，无创血管夹夹至肝左叶、中叶肝蒂的分支30 min，夹闭后肝的颜色由红色变为暗紫红色，表明模型制作成功。在30 min后去除血管夹复流形成再灌注，逐层关腹。6 h后开腹取小肠中段组织。IR+L-NAT组在制备IR模型前30 min腹腔注射10 mg/kg L-NAT，其他处理同IR组。Sham组仅行麻醉开腹分离至左叶、中叶的入肝管道，但不阻断肝血流。

1.2取材与切片 取部分大鼠小肠组织，生理盐水冲洗肠粪便物，组织置于多聚甲醛(4 g/L)固定，48 h后梯度浓度蔗糖沉底过夜，冰冻切片(厚10 mm),常规染色。

A～C:(×200)；D～F:(×400)

图1小肠上皮细胞的形态变化(HE染色)

A～C:Bcl-2;D～F:Bax;G～I:Caspase-3

图2免疫组织化学染色显示Bcl-2、Bax和Caspase-3在小肠上皮细胞中的表达(×400)

1.3HE染色 常规冰冻切片，HE染色，在光学显微镜下观察小肠绒毛和上皮细胞的变化。

1.4免疫组织化学染色 采用SP法进行Caspase-3(Cell Signaling，1∶200)、Bcl-2(Santa Cruz,1∶200)、Bax(Santa Cruz,1∶200)免疫组织化学染色，以PBS代替一抗做阴性对照。

2 结 果

2.1小肠光镜病理观察 HE染色显示，Sham组肠绒毛完整，排列整齐,隐窝结构明显。IR组肠绒毛结构破坏严重，绒毛顶部大量脱落破裂,溃疡严重，上皮细胞变性坏死，大量炎性细胞浸润，肠壁各层出现出血，隐窝结构破坏。IR+L-NAT组形态变化明显减轻，小肠绒毛基本完整，小肠绒毛上皮细胞轻度水肿，有少量炎性细胞浸润(图1)。

2.2免疫组织化学Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达 免疫组织化学染色显示，免疫组织化学阳性信号可不同程度表达于小肠黏膜上皮细胞中，呈棕黄色或黄褐色颗粒，其中，Bax在细胞质表达，Bcl-2在细胞质和细胞膜表达，Caspase-3在细胞核表达。Bax、Bcl-2和Caspase-3在Sham组均无表达。IR组Caspase-3、Bax、Bcl-2等阳性细胞数量均明显增多。与IR组比较，L-NAT干预后Caspase-3与Bax的表达减弱，Bcl-2表达增加(图2)。

3 讨 论

肝脏是人体最大的实质性器官，血供比较丰富。在肝脏移植、处理严重肝创伤等手术时，为减少术中出血，经常需要阻断肝门，而重新恢复血液供应则可造成肝脏的缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)[9]。近年来有研究表明，肝脏缺血缺氧使大量Ca2+进入细胞内造成钙超载，促使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，为氧自由基的产生提供催化剂。肝脏缺血缺氧时，肝细胞的无氧酵解，会使酸性代谢产物堆积过多，pH值降低，而灌注后pH值的改变，则会促进细胞死亡，加重缺血再灌注损伤(IRI)；同时，肝脏中的kupffer细胞被激活并释放大量毒性介质，干扰DNA的逆转录过程，使细胞内具有酶活性的蛋白质失活，细胞发生严重的功能代谢紊乱，导致肝脏发生严重损伤[10-11]。另有研究表明，肝脏IR不仅影响肝脏结构和生理功能，还参与多种远隔器官的缺血/缺氧损伤[12]。张东江等[13]发现，随HIRI发生时间延长，肾小球、肾小管细胞发生水肿坏死，出现严重肾功能不全表现。赵磊等[14]发现发生HIRI后肺泡腔完整性被破坏，间隔明显增厚，肺泡上皮细胞变性坏死，并伴有肺水肿。杨进城等[15]发现肝脏IR后，肾脏、胰腺、心脏中测得SOD活性下降及MDA水平升高，提示HIRI可诱发多器官功能障碍综合征(MODS)[16]。

当肝门被阻断后，门静脉的反流与入肝血量明显减少，在加重肝脏缺血的同时，不可避免的造成了肠道的淤血损伤，出现小肠黏膜屏障破坏，肠黏膜通透性增高，造成细菌移位，形成内毒素和菌血症[17]。当重新恢复血流后，内毒素随血液回流入肝脏，进而加重HIRI。肝门阻断后门脉回流受阻导致肠道淤血损伤，当肝脏再灌注时毒性物质又可经血液流经肠道，导致肠道的双重损害[18]。因此，肠道被誉为是外科手术的“中心器官”。有学者发现，肝门阻断后小肠会出现淤血性损伤[19]。周京安等[20]发现由于小肠绒毛发卡式结构的存在，其顶部黏膜层细胞易出现脱落坏死、线粒体肿胀和细胞连接松弛。赵佐庆等[21]发现犬小肠在IR后肠黏膜淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞数量增多，同时Bax、c-Fos基因表达增多，提示小肠IRI与细胞凋亡密切相关。综上所述，在肝脏缺血手术中保持肠黏膜完整性，减少肠道的损伤具有重要的意义。

细胞凋亡是IR中细胞死亡的重要方式，而线粒体途径是凋亡的主要途径。Bcl-2家族和Caspase家族在线粒体途径中有极为重要的调控作用。Caspase-3在促进细胞凋亡中起关键作用，是内源性细胞凋亡和外源性细胞凋亡共同的效应分子，可启动细胞凋亡，从而形成Caspases依赖性的细胞凋亡[22]。Bcl-2家族中Bax、Bcl-2是目前已知的与细胞凋亡密切相关的功能相对立的基因。研究表明，抗凋亡基因Bax和促凋亡基因Bcl-2的比例可影响细胞凋亡的状态,即当Bcl-2与Bax比值增高时，促进细胞存活，否则促进细胞凋亡[23]。Bcl-2、Bax作为上游调控基因可改变线粒体膜的通透性，控制下游Caspase-3蛋白酶的活性和Cyt-c的释放。线粒体释放的Cyt-c与Apaf-1、dATP结合形成凋亡体，并招募pro-Caspase-9使其激活为活性Caspase-9，后者又可激活Caspase-3，促进细胞凋亡[24-27]。由此可见，在细胞程序性死亡中，Cyt-c发挥最后通路的作用。本实验发现，与IR组比较，IR+L-NAT组Caspase-3与Bax表达减弱，Bcl-2表达增强，Caspase-3的表达降低。说明L-NAT可以通过抑制Cyt-c从线粒体向胞质中释放，减少活化型Caspase-3的表达，从而减少细胞的凋亡。

研究表明，P物质是一个由11个氨基酸组成的多肽，它作为一种兴奋性胃肠激肽大量分布在肠道的肌间神经丛和黏膜下神经丛。P物质通过与NK-1受体结合，刺激肠黏膜分泌水和电解质，加快离子转运，导致肠管扩张，通透性增加，同时诱导细胞表达TNF-α和分泌TNF-α调节炎性细胞因子[3]。朱金照等[26]发现，肝衰竭时小肠的功能减弱与P物质的分布有一定的关系。L-NAT是P物质特异性受体NK-1的拮抗剂，是由美国FDA批准的用于治疗恶心、呕吐和精神病变的药物。有学者已证实L-NAT对新生鼠脑缺血缺氧具有保护作用[27-28]，但对肝脏缺血后肠损伤的保护作用未见报道。本研究通过肝门阻断法完全阻断肝脏血流，制备肝脏IR模型。研究发现Sham组肠绒毛完整，排列整齐。IR组肠绒毛结构破坏严重，顶部绒毛大量脱落破裂,上皮细胞变性坏死，大量炎性细胞浸润。而IR+L-NAT组形态变化明显减轻，小肠绒毛基本完整，较IR组有较大改善。因此可以说明L-NAT对肝脏缺血后肠损伤具有保护作用。

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ProtectiveeffectofN-acetyl-L-tryptophanonintestinaldamageafterrathepaticischemiareperfusion*

WangShuhui1,JiangHongxin2,LiXiaoshuang2,HuMengqi3,YuHai2,ZhangMing2,YuShuna2,WangJianxin2,JiangJiying2△

(1.Class17ofGrade2013,ClinicalMedicalCollege,WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053,China;2.TeachingandResearchingSectionofAnatomy，WeifangMedicalCollege，Weifang,Shandong261053,China;3.Class7ofGrade2013,ClinicalMedicalCollege,WeifangMedicalCollege,Weifang,Shandong261053,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of N-acetyl-L-tryptophan (L-NAT) on intestinal damage after rat hepatic ischemia reperfusion.MethodsTwenty-four healthy adult rats were divided into the sham operation group (Sham),ischemia reperfusion group (IR),ischemia reperfusion and N-acetyl-L-tryptophan group(IR+L-NAT).The hepatic ischemia reperfusion model was established by occluding the afferent vessels of the left and middle lobes.The morphological structures of the small intestine were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining.The expressions of active caspase-3,Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemistry staining.Results(1) In the IR group,the structure of intestinal villis was destroyed,the intestinal mucosa showed congestion and exfoliation,the epithelial cells had degeneration and necrosis,and infiltration of inflammatory cells appeared;which could be alleviated by L-NAT.(2)The immunohistochemistry showed that compared with the Sham group,the expression of active caspase-3,Bcl-2 and Bax in the IR group was increased,after L-NAT intervention,the Bax and caspase-3 expression was decreased,while the Bcl-2 expression was further increased.ConclusionL-NAT could inhibit the apoptosis of small intestinal epithelial cells caused by liver ischemic reperfusion and attenuates intestinal epithelial damage.

ischemia-reperfusion injury;small intestine;N-acetyl-L-tryptophan;apoptosis；rat

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.002

R657.3

A

1671-8348(2017)27-3748-04

2016-11-05

2017-05-21)

山东省自然科学基金资助项目(ZR2010HM006;ZR2014HL020；ZR2014HL021)；山东省教育厅资助课题(J11LF14)；山东省医药卫生科技发展计划资助课题(2014WS0464)；潍坊医学院科技创新研究基金资助项目(K1301001)；潍坊医学院大学生科技创新基金资助项目(KX20150091)；2015年地方高校国家级大学生创新创业训练计划(201510438010;201510438007)。

王淑惠(1994-)，本科,主要从事肝损伤研究。△

，E-mail:jiangjiying2002@163.com。