福州地区HBsAg—/HBVDNA+献血者乙肝病毒S区 MHR变异特征分析

赵亮++周晓真++涂东晋++吕蓉

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.23.010

[摘要] 目的 分析福州地區HBsAg-/HBV DNA+献血者HBV的基因型及主要亲水区（MHR），尤其是其中 “a”决定簇区氨基酸的变异情况，为进一步研究隐匿性乙肝病毒感染的发生机制提供参考。方法 对收集的2013年7月—2014年10月福州地区献血者的90 874名献血者血液标本进行HBsAg ELISA与单人份核酸检测，对筛查出的HBsAg-/HBV DNA+标本，进行HBV DNA的提取和S区基因的扩增和测序。测序结果进行进化分型，分析 MHR中氨基酸序列的变异情况。选取15例前期研究所得的HBsAg+/HBV DNA+标本的测序结果作为对照，比较两类标本在“a”决定簇区蛋白序列变异上的差异。结果 16份测序结果中B基因型15份，C基因型1份。15例标本中13例在MHR内共发生了33次氨基酸的变异，其中25次集中在“a”决定簇区，HBsAg-/HBV DNA+标该组“a”决定簇区的变异率要高于HBsAg+/HBV DNA+标该组。变异的形式主要为单个的氨基酸的点替换，另有7例标本在124位与125位氨基酸间发生了9个碱基的非移码插入，造成该位点间“TNR”3个氨基酸的插入。结论 福州地区献血者HBsAg-/HBV DNA+血液标本中HBV的基因型以B型为主， MHR的氨基酸变异主要集中在 “a”决定簇区，有本地区的地域特点。研究中新发现的3个氨基酸“TNR”的插入变异，可能影响HBsAg的检出。

[关键词] 乙型肝炎病毒；献血者；基因突变；乙型肝炎表面抗原

[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）08（b）-0010-05

Analysis of Variation Characteristics of MHR in Region S of HBSAG-/HBVDNA+ among Blood Donors in Fuzhou

ZHAO Liang1， ZHOU Xiao-zhen1， TU Dong-jin1， LYU Rong2

1.Fujian Blood Center， Fuzhou， Fujian Province， 350004 China； 2.Anhui Blood Center， Hefei， Anhui Province， 230071 China

[Abstracts] Objective This paper tries to analyze the HBV genotypes and amino acids variability in major hydrophilic region （MHR）， especially in “a” determinants region， among HBsAg-/HBV DNA+ blood donors in Fuzhou and to provide the reference for the further study of occult hepatitis B virus infection mechanism. Methods Plasma samples of 90 874 cases of blood donors from July 2013 to October 2014 in Fuzhou were screened and tested by HBsAg ELISA and nucleic acid. HBV DNA was extracted and gene of S region was amplified for HBsAg-/HBV DNA+ samples. Evolutionary typing was conducted for sequencing results， and variations of amino acid sequence in MHR were analyzed. 15 cases of HBsAg+/HBV DNA in previous study were selected as the control group， the sequence variations of proteins in “a” determinants region was compared among sub-specimens. Results Among the 16 cases of sequencing results， 15 cases were genotype B and 1 case was genotype C. Among the 15 specimens， a total of 33 variations of amino acids occurred in MHR in 13 specimens， 25 of which concentrated in “a” determinants region. Variation rate in the “a” determinants region of specimens in the group of HBsAg-/HBV DNA+ specimens was higher than that in the group of HBsAg+/HBV DNA+ specimens. The main variation was the point substitution of a single amino acid. In addition， in another 7 specimens， non-frameshift insertions of 9 bases occurred between 124 and 125 amino acids， causing the insertion of three amino acids TNR at this site. Conclusion The genotypes of HBV in specimens of blood donors in Fuzhou were mainly type B， and the variation of MHR mainly concentrated in “a” determinants region， showing regional characteristics of this region. The insertion variation of newly discovered three amino acids TNR may affect the detection of HBsAg.endprint

[Key words] Hepatitis B virus； Blood donors； Gene mutation； Hepatitis B surface antigen

该研究曾对2011年11月—2013年3月福州地区的献血者血液标本进行过HBsAg和HBV DNA的筛查，发现HBsAg-/HBV DNA+标本检出率为0.073%[1]。献血人群主体是健康人群，造成献血者标本HBsAg-/HBV DNA+的主要原因为窗口期和隐匿型乙型肝炎病毒感染（Occult Hepatitis B virtus Infection，OBI），OBI所占的比例甚至高达90%～95%[2]，对临床输血安全造成了威胁。该研究有幸和安徽省血液中心合作，对该地区2013年7月—2014年10月福州地区献血者的90 874名献血者血液标本筛查所得的的HBsAg-/HBV DNA+的无偿献血者标本，进行HBV的DNA的提取和S区扩增测序，分析乙型肝炎病毒的基因型和S区的MHR的变异特征，为研究OBI的发生机制提供一个参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

福建省血液中心所采集的该地区献血者的血液标本，献血者征询均符合GB18467-20111《献血者健康检查要求》，标本均经过ALT快速法和HBsAg金标试纸初筛合格。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：HBsAg ELISA试剂，单人份核酸联合检测及鉴别试剂Procleix Ultrio Assay，所有试剂均批批检合格，并在效期内使用。主要仪器：Microlab STAR全自动加样仪，全自动酶免分析仪，Procleix TIGRIS核酸检测系统。

1.3 检测方法及判定规则

1.3.1 血清学ELISA检测HBsAg 标本的HBsAg检测采用酶联免疫的两步法，步骤按试剂说明书要求，结果S/CO值≥0.9判为反应性，<0.9判为非反应性（该中心灰区设为0.9≤S/CO值<1.0）。HBsAg反应性标该次日作双孔复检，双孔中只要有一孔结果为反应性，判为HBsAg（+），否则判为HBsAg（-）。

1.3.2 单人份核酸检测 该中心采用TMA法单人份核酸检测（ID-NAT）的模式，核酸检测与ELISA检测同步进行，先进行HBV/HCV/HIV核酸的联检，检测反应性的标本再进行HBV/HCV/HIV单项的鉴别试验，筛出HBV DNA反应性的标本，判为HBV DNA（+）。

1.4 HBsAg-/HBV DNA+标本HBV DNA的提取和S区基因的扩增测序

留取HBsAg-/HBV DNA+标本的血袋血浆进行分装，-80℃保存，寄送至安徽省血液中心完成HBV DNA的提取和S区基因的扩增，具体反应体系和扩增条件参照发表的文献[3]。PCR产物由安徽省血液中心寄送上海生工生物工程公司双向测序，测序结果反馈于该中心做进一步分析。

1.5 HBsAg+/HBV DNA+标本基因序列的获得

15例HBsAg+/HBV DNA+标本来源于前期研究所收集的无偿献血者标本，标本的HCV抗体、HIV抗体、梅毒螺旋体抗体和ALT均为阴性。HBV DNA的提取、扩增和测序相关试剂和反应条件见参照文献[1]，所得的DNA序列为全基因组中465～680 bp位置，氨基酸的序列为第108～170位，标本均为B基因型。

1.6 HBV的基因分型

使用 MEGA7.0.18软件对测序结果进行分析，将HBsAg-/HBV DNA+标本的测序结果与网站https：//hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbIndex 数据库中各种基因型HBV的标准株进行比对及进化分析。

1.7 MHR氨基酸序列的變异分析

下载相应的基因型的标准株的序列作为参照，用MEGA7.0.18软件将核苷酸序列转换为氨基酸序列，将HBsAg-/HBV DNA+组标本和HBsAg+/HBV DNA+组标本的氨基酸序列与标准株进行比对，对HBsAg-/HBV DNA+标本“a”决定簇区和“a”决定簇区以外的MHR的氨基酸变异率作一比较，分析氨基酸变异在MHR的分布情况。将两组标本“a”决定簇区的氨基酸序列的变异情况作一比较，分析可能存在的影响献血者HBsAg检出的氨基酸变异位点。

1.8 统计方法

应用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，分类计数资料采用 χ2检验，P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBsAg-/HBV DNA+标本的检出情况

90 874名最终检测出HBsAg-/HBV DNA+标本共68份，检出率为0.075%。HBsAg（-）/HBV DNA（+）标本的检出率与该小组2011年11月—2013年3月研究的所得的检出率（0.073%）相比，差异无统计学意义（χ2=0.025， P﹥0.05）。

2.2 S区基因的测序情况

68份HBsAg-/HBV DNA+标本送寄送至安徽省血液中心进行HBV DNA的提取和S区基因的扩增，最终有15份标本成功完成了测序，其中3份结果采用1#引物用巢式PCR方式扩增得到，产物覆盖整个S基因区（标本的编号为FJ47-S1、FJ184-S1和 FJ197-S1）；另外13份结果为2#引物采用普通PCR方式扩增得到，产物为部分S基因（标本的编号为FJ66-S4、FJ204-S4、FJ34-S4、FJ39-S4、FJ46-S4、FJ47-S4、FJ71-S4、FJ115-S4、FJ117-S4、FJ199-S4、FJ11-S4、FJ31-S4 和FJ194-S4）。编号为FJ47标本，在2种PCR方法中分别得到了两个不同的序列，合计得到16个测序结果。endprint

2.3 HBV的序列分析与基因分型

将16份标本的测序结果用MEGA7.0.18软件与HBV的A-H 基因型各型的标准株进行比对和进化分析，16份标本中除1份为C基因型（FJ194），其余均为B基因型。

2.4 MHR氨基酸变异情况分析

通过与已发表的数据库中的近源的B型标准株（AB219428与D00331）和C型标准株（GQ358158与GQ924620）的蛋白序列进行比对，16个HBsAg-/HBV DNA+标本的测序结果中除了1份（C型FJ194-S1）在MHR无氨基酸的变异外，其余15份在该区合计发生33次的氨基酸的变异。这33次的变异除了8次发生在“a”决定簇区以外的MHR范围内（第99～123位和第148～169位氨基酸区），其余的25次变异都集中于“a”决定簇区（第124～147位氨基酸区）。HBsAg-/HBV DNA+标本在“a”决定簇区的氨基酸变异率（6.51%）要明显高于MHR的其他区域（2.08%）（χ2=25.972，P<0.05）。HBsAg+/HBV DNA+组的标本在第108～170位氨基酸合计发生了12次氨基酸的变异，均为单个氨基酸的替换，变异也集中于“a”决定簇区（9/12），其 “a”决定簇区的氨基酸的变异率（2.50%）要低于HBsAg-/HBV DNA+组的标本（χ2=11.985，P<0.05）。HBsAg-/HBV DNA+ 组标本“a”决定簇区氨基酸的变异类型主要有两类，一类为碱基的点突变引起的单个氨基酸的替代（18/26），另一类为由9个碱基（ACAAACCGC）的非移码插入所引起的3个氨基酸TNR插入（8/26），共有7例标本发生此类变异。而HBsAg+/HBV DNA+组标本的氨基酸的变异均为碱基的点突变引起的单个氨基酸的替代，根据氨基酸亲水性和疏水性的分类标准，从电荷的改变对“a”决定簇区氨基酸的变异情况作进一步的分析，结果见表1。

3 讨论

该研究通过与既往研究的纵向比较，发现福州地区献血者HBV窗口期感染与OBI的情况比较稳定。68份HBsAg-/HBV DNA+标本S区基因扩增的成功率仅为23.5%，推测与窗口期感染和OBI的病毒载量低有关[4-5]相关学者[7]研究发现OBI的病毒株可通过输血传播[6]，胡莉萍等学者也发现隐匿性乙型肝炎可通过家庭成员间的密切接触传播。 该研究检出的HBsAg-/HBV DNA+标本除1例为C基因型，其余均为B型，与我国HBV流行南方多B型，北方多C型的地域特点一致，提示引起OBI的病毒株与野毒株可能有相同的传播途径。

HBsAg-/HBV DNA+标本血清学检测阴性的可能原因中，S基因区突变所引起的HBsAg合成分泌障碍以及MHR，特别是“a”决定簇的抗原表位改变是目前OBI发生机制研究最多的方面。目前国内关于“a”决定簇的研究所报道的以单个氨基酸点替换多见，连续多个氨基酸的插入变异较少见。早期侯金林等[8]学者曾发现3例HBsAg阴性的感染者S区第123～124位氨基酸间出现2～3个氨基酸的插入。后来陈建宏等学者也在1例HBsAg阴性的感染者的标本中检出了S区第126～126位氨基酸间“RPCMNCTI”插入变异[9]。该研究在HBsAg-/HBV DNA+的献血者标本新发现了第124～125位氨基酸间3个氨基酸“TNR”的插入变异，该变异出现在8例献血者的标本中，其中1例（FJ47-S4）同时还发生了C124R的氨基酸替换。“a”决定簇区富含半胱氨酸，并借助124与137、139与147位半胱氨酸间的二硫键形成双袢结构，维持HBsAg的抗原性。第124位半胱氨酸的替换及其相邻位点的插入变异，极大可能会影响二硫键的形成，造成HBsAg关键表位的构形改变，引起OBI。

该研究中HBsAg-/HBV DNA+的献血者标本乙肝病毒MHR的氨基酸变异主要集中在“a”决定簇，考虑到发生变异标本均为B基因型，故选取该小组前期研究所得的15份B基因型HBsAg+/HBV DNA+獻血者标本所测得的“a”决定簇氨基酸序列作为野毒株对照。HBV复制有逆转录的过程，故错配率高，易发生基因的突变，该研究中二组的标本在相对保守的“a”决定簇都发现有氨基酸的变异，显示出病毒在“a”决定簇在人群中的多态性。HBsAg-/HBV DNA+标本在“a”决定簇的氨基酸变异要高于HBsAg+/HBV DNA+标本。有学者通过对HBV单克隆载体的构建与表型的分析发现，S区T131N和M133T的变异可能造成HBsAg无法抗体识别[9]。王淏等[10]在对广州地区的献血者HBsAg-/HBV DNA+标本MHR的研究中发现T126和Q129出现氨基酸的高频点置换，推测可能是引起OBI的高突变位点。但该研究发现T126A、Q129R、T131N和M133T在HBsAg+/HBV DNA+组的标本均有出现，其中，T126A、T131N和M133T同时出现HBsAg-/HBV DNA+组和HBsAg+/HBV DNA+组的标本中，提示此类变异有可能对HBsAg+的检出的影响有限。研究中其他的氨基酸的变异与国内同类研究所发现的变异鲜少有重合[4-5，8-11]。该小组曾对2011年11月—2013年3月福州地区无偿献血者的HBsAg-/HBV DNA+标本的“a”决定簇的氨基酸变异作过研究，发现P127T、T131N、M133T出现次数较多，该次研究也发现同样的情况，加上出现高频次的第124～125位氨基酸间出相同的插入变异，提示本地区的HBsAg-/HBV DNA+献血者中MHR氨基酸的变异情况有自身的地域特点。

为了更好的了解氨基酸的点替换对“a”决定簇表位的影响，该研究分析了替换前后氨基酸的类型，发现HBsAg+/HBV DNA+标该组大部分的点替换氨基酸的极性未发生变化（5/9），包括前面提到的T131N和M133T。HBsAg-/HBV DNA+组与HBsAg+/HBV DNA+组标本未对上的10处点替换中，大部分则发生了氨基酸极性的变化（6/10），这其中很可能包含有引起HBsAg检出阴性的关键变异点，对进一步研究OBI的发生机制提供参考。endprint

现阶段隐匿性乙型肝炎病毒感染发生机制的研究中，涉及到OBI标本的判定方面有几点值的关注。①OBI的定义源自2008年欧洲肝病协会，指感染者肝脏中检出HBV DNA，血清血浆中检出或者不能检出HBV DNA，且HBsAg检测阴性。因肝组织标本的在临床上的获得不易，研究者更多的采用血清及血浆的标本，研究标本的选取上偏向于血浆或血清能检出HBV DNA标本；②在标本HBsAg的血清学检测项目上，随着新的检测技术和灵敏度更高的试剂出现，早期研究中HBsAg阴性的标本有可能在现阶段是判为HBsAg阳性的标本；③同一时期不同品牌的HBsAg检测试剂盒由于生产工艺的差异以及所选用的包被抗体类型的不同，有的为单克隆抗体，有的为多克隆抗体，对不同变异的HBsAg的检出能力也存在差异。国外已有学者同时对多个不同厂家的HBsAg检测能力作了比较证实了该点[12]。④HBV复制扩增的过程中存在逆转录，碱基的错配率高，易变异，因此感染的个体上看，OBI宿主体内的乙肝病毒是以准种的状态感染，同时期有可能体内共存有不同的HBV变异株，不同的变异株在选择压力下，在宿主的整个病毒群体中所占的比例处于一个相对平衡的状态。陈建宏等[9]对1例OBI患者不同时期留取的4份血液标本所得到的乙肝病毒构建载体进行基因表型的分析，发现患者的病情变化是由多种S基因突变的病毒株引起的。因此，研究中所得到的HBV DNA的基因序列有可能并不能完全的代表OBI患者体内HBV的基因变异情况。这也就能解释该研中FJ47這例标本为何在二种PCR方法中分别测得了氨基酸变异情况完全不同的二个基因序列。

综上所述，OBI的发生机制相当复杂，研究中针对MHR的氨基酸的变异就有诸多的报道，该研究对福州地区献血者的HBsAg-/HBV DNA+标本MHR中，特别“a”决定簇区氨基酸变异研究，所发现的一些新的变异点，对研究该地区的OBI的流行情况和发生机制具有一定的参考意义。

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（收稿日期：2017-05-13）endprint