mmu-miR-3475-3P在心脏发育中的生物信息学分析*

沈 兴，潘 博，周挥铭，刘玲娟，田 杰

(1.重庆医科大学附属儿童医院心内科，重庆 400014；2.西南医科大学附属医院儿二科，四川泸州 646000)

·生物信息学·

mmu-miR-3475-3P在心脏发育中的生物信息学分析*

沈 兴1，2，潘 博1，周挥铭1，刘玲娟1，田 杰1

(1.重庆医科大学附属儿童医院心内科，重庆 400014；2.西南医科大学附属医院儿二科，四川泸州 646000)

目的探讨mmu--miR-3475-3P可能参与的生物学过程及信号通路。方法用实时荧光定量PCR方法测定mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心脏和成熟心脏中的表达。再综合应用TargetScan、miRDB、miRanda等常用microRNA在线数据库对miR3475-3p进行靶基因预测，对所得靶基因进行基因功能注释(Go)和信号通路分析。结果mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心脏和成熟心脏中存在明显的表达差异，运用TargetScan、miRDB、miRanda对miR3475-3P进行生物信息学分析发现该microRNA可能调控441个靶基因。结论mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心脏高表达，其预测的靶基因富集于多个信号通路及细胞生物学过程。

mmu-miR-3475-3P；生物信息学；靶基因；心脏发育

目前，心脏疾病的发病率逐年上升，已成为威胁人类健康的主要疾病之一[1]。对正常心脏发育过程的深入解析可为实现对心脏疾病的早期防治提供理论依据。心脏的构建涉及多细胞、多基因，也受到遗传与环境因素的共同影响。表观遗传作为遗传与环境因素之间的桥梁在胚胎心脏发育过程中具有重要作用，特别是表观遗传中的microRNA被认为广泛参与了心脏的发育及疾病的发生、发展[2-5]。mmu-miR-3475-3P是本课题组在前期研究中发现的在胎鼠心肌中高表达的microRNA，目前对其的研究较少。本研究拟通过生物信息学分析，预测mmu-miR-3475-3P的关键靶基因和涉及的信号通道，为进一步行mmu-miR-3475-3P在心脏发育中的功能、机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物采用清洁级昆明孕鼠，购于重庆医科大学实验动物中心[合格证号：SYXK(渝)2007-0016]。实验用引物均购自广州市锐博生物科技有限公司，RNA酶抑制剂购自美国Thermo Scientific公司，脱氧核糖核苷三磷酸购自Tiangen公司，绿色荧光染料购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1mmu-miR-3475-3P表达量在胚胎鼠和成年鼠心脏中的检测 以胚胎14.5 d的昆明小鼠(n=3)和生后21 d的成年昆明小鼠(n=3)为对象，用Trizol试剂提取总RNA，并利用紫外分光光度计K5500在OD260/280,OD260/230波长下进行RNA质检，以该RNA作为模板，以1 μg总RNA反转录成CDNA第1链，并以其为模板进行PCR扩增，根据小鼠mmu-miR-3475-3P(MIMAT0015219)的编码序列5′-UCU GGA GGC ACA UGG UUU GAA-3′设计合成PCR引物，按如下条件进行PCR反应：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 1 s，共40个循环，绘制溶解曲线。以U6作为反应内参，microRNA的含量通过2-△△ct法定量计算。

1.2.2mmu-miR-3475-3P生物信息学分析 综合应用TargetScan、miRDB、miRanda等常用microRNA在线数据库对mmu-miR3475-3p进行靶基因预测。对所得靶基因进行基因功能注释(gene ontology，Go)(http://www.geneontology.org/)，并建立起统计模型，分析整个基因组中最显著的功能，计算这些基因在某(多)个特定的分支的超几何关系，根据基因的GO 注释，选择本物种的所有基因作为背景基因，用超几何分布计算P值，以P<0.05为显著性阈值分别得到相对于背景具有统计意义的高频率注释，从而得到基因集合在GO类别上的分布信息和显著性情况。将mmu-miR3475-3p的预测靶基因进行基于Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG，http://www.genome.jp/)的生物学通路数据分析，通过Fisher Exact Test计算P值，以P<0.05为显著性阈值得到基因集合相对于背景具有统计意义的信号转导及疾病通路。

“喂！放我出去！”步凡用力地敲击着门板，但回应他的，只有门外的嬉笑声：“黄皮仔，你就在这里好好待着吧！明天早上扫地的人会来营救你的！”

2 结 果

人们根据第二摩崖石刻“永乐十八年领军至此”“洪熙元年领军至此”“宣德七年领军至此”，普遍认为刘清共三次来到船厂。

图1 mmu--miR-3475-3P靶基因文恩交集图

2.2mmu-miR-3475-3P生物信息学分析 运用TargetScan、miRDB、miRanda对mmu-miR-3475-3P进行靶基因预测分别获得3 797、518、8 431个靶基因，设3个数据库中共同预测的靶基因为候选基因，共441个(图1)。针对靶基因的GO分析提示mmu-miR-3475-3P涉及多种生物学过程(图2)，其中多个基因涉及心脏、血管发育、跨膜离子通道转运等(表1)。利用KEGG经典生物通路数据库对mmu-miR-3475-3P的靶基因进行信号通路富集分析，结果提示441个靶基因参与广泛的信号转导通路，包括代谢通路、内吞作用、Wnt信号通路、Hippo信号通路等，而其中与心血管发育密切相关的Wnt信号通路共涉及15个基因，Hippo信号通路共涉及8个基因，Notch信号通路共涉及2个基因，见表2。

2.1mmu-miR-3475-3P在胚胎小鼠和成年小鼠心肌中的表达量分析 mmu-miR-3475-3P在胎鼠14.5 d的心肌中的表达量明显高于成年鼠心肌中的表达量，在胎鼠中的表达量为17.41±5.74，在成年鼠心肌中的表达量为1.00±0.54，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 mmu--miR-3475-3P靶基因生物学GO分析

项目P基因心脏起搏细胞的发育0.013Popdc2,Maml1冠状血管的形成0.017Nrp1,Pdgfrb调节心肌细胞跨膜电位0.021Atp2a2,Pml钾离子内流0.026Kcnj5,Atp1b2,Atp1b1心肌舒张0.026Atp1b1,Atp2a2依赖钙离子信号的心肌收缩调控0.044Atp1b1,Atp2a2

表2 与心血管发育密切相关的KEGG经典生物通路示例

3 讨 论

microRNA是一类小分子非编码的RNA分子，起到对基因表达的负性调控作用，广泛参与细胞的分化、迁徙，组织器官的形成等。生物信息学预测microRNA可能控制着约70%的生理过程，但只有小部分microRNA的靶基因及功能得到了初步阐述，大部分microRNA的功能仍然未知。研究未知microRNA对组织器官的发育及调控机制仍然十分重要。小鼠心脏因为与人类心脏相似，一直作为研究人类心脏的较好的动物模型[6]。

本研究在前期研究中发现mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎期高表达，提示其可能参与了心脏的早期发育。对该microRNA的Go分析发现该microRNA的靶基因涉及popdc2、pdgfrb、Atp1b1、Atp2a2等基因。而目前的研究表面大部分基因与心脏发育及疾病形成有关。如研究表明popdc2是鸡胚胎心脏发育成熟的标志基因[7]，而且popdc2存在于大部分哺乳动物的心脏，沉默popdc2基因表达可导致斑马鱼胚胎心脏和骨骼肌发育障碍[8]，沉默小鼠popdc2基因表达可导致心脏传导系统在应激诱导下功能障碍，可诱发小鼠出现窦性心动过缓[9]，下调popdc2表达可促进新生大鼠心肌细胞增殖，促其进入细胞循环参与心肌修复，且popdc2在心肌中表达很高，表达量在胚胎期较少，但生后随着大鼠出生时间增加表达量逐渐升高[10]，与mmu-miR-3475-3P的表达呈负相关关系。对microRNA的信号通路分析发现mmu-miR3475-3p的靶基因富集于心脏发育密切相关的Notch、Wnt、Hippo信号通路，已有大量研究揭示这些通路调控着心脏的发育进程。如Notch信号通路调控心肌分化及心脏瓣膜、心室小梁，以及动脉血管发育；Notch信号通路中基因JAG的突变将引起法洛四联症的发生[11-12]。而Wnt通路的异常是先天性心脏病的高风险因素[13-14],持续激活内皮细胞的Wnt经典信号通路可导致心力衰竭的发生等[15]。

(2)胶凝材料水化生成的凝胶对Pb2+的吸附作用，Pb2+以类质同相进入AFt和复盐结构内部等的协同作用，是其固铅效率显著高于水泥的重要原因。

本研究证实了mmu-miR3475-3p在小鼠胚胎期和成年心肌中的表达有明显差异。通过生物信息学分析揭示其可能参与心脏发育及疾病形成。但在生物信息学预测分析中，存在着假阳性或者假阴性结果。mmu-miR3475-3p是否在心脏发育中起到重要的调控作用仍需进一步研究证实，包括经典的过表达和沉默策略研究mmu-miR3475-3p对心肌细胞功能的影响，以及其他分子机制的研究等。

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Bioinformaticsanalysisformmu-miR-3475-3Pincardiacdevelopment*

ShenXing1,2,PanBo1,ZhouHuiming1,LiuLinjuan1,TianJie1

(1.DepartmentofCardiology,AffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;2.SecondDepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the mmu-miR-3475-3P possible participating in biology process and signal pathway.MethodsThe expression of mmu-miR-3475-3P in the mature mouse heart and in the embryonic mouse heart was measured by qRT-PCR.The target genes were predicted through comprehensively using the common microRNA on-line databases such as TargetScan,miRDB and miRanda,and then the obtained targeted genes were performed the gene function annotation and signal pathway analysis.ResultsThere was significant difference between the expression of mmu-miR-3475-3P in the embryonic mouse heart and the expression in the mature heart.Bioinformatics analysis by using TargetScan,miRDB and MiRanda on miR3475-3P revealed that microRNA was likely to regulate 441 target genes.Conclusionmmu-miR-3475-3P is highly expressed in the embryonic mouse heart.The target genes predicted by mmu-miR-3475-3P are enriched in multiple signal pathways and cellular biological processes.

mmu-miR-3475-3P;bioinformatics analysis;target gene;cardiomyogenesis

R725.4

A

1671-8348(2017)26-3671-03

2017-02-22

2017-06-21)

《重庆医学》对临床研究论文医学伦理学要求

《重庆医学》编辑部

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.025

泸州市科技厅-西南医科大学联合课题[2015lzcyds05(9/12)]。

沈兴(1976-)，副教授，在读博士，主要从事儿童心血管疾病基础与临床方面研究。

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