间接阻抗法检测酸性罐藏食品商业无菌的研究

杜寒春，叶开富，刘绍刚，徐蝉，苏梅清，谭学才，*

（1.广西壮族自治区分析测试研究中心，广西南宁530022；2.广西民族大学化学化工学院，广西高校食品安全与药物分析化学重点实验室，广西南宁530008）

间接阻抗法检测酸性罐藏食品商业无菌的研究

杜寒春1，叶开富1，刘绍刚2，徐蝉1，苏梅清1，谭学才2，*

（1.广西壮族自治区分析测试研究中心，广西南宁530022；2.广西民族大学化学化工学院，广西高校食品安全与药物分析化学重点实验室，广西南宁530008）

建立间接阻抗法快速检测酸性罐藏食品商业无菌的方法。选取酸性罐藏食品中易污染的多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母作为试验菌株，对间接阻抗法的临界值、适用性、灵敏度、测量持续时间及罐头样品取样量等应用条件进行研究，并与国标法GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》进行比对。研究表明，建立的间接阻抗法与国标法的检测结果完全一致，但比常规方法缩短7 d，3 d内即可判定样品是否为商业无菌。

间接阻抗法；酸性罐藏食品；商业无菌

Abstract：A method for rapid detection of commercial sterility in acid canned food was established by indirect impedance method.The microorganisms which are easily contaminated in acid canned foods，such asPaenibacillus polymyxa，Leuconostoc mesenteroidesandHansenula anomalawere selected as experimental strains to study of the threshold，applicability，sensitivity，measurement duration and sample volume of canned food of the indirect impedance method.Compared with the national standard method GB 4789.26-2013＜National food safety standard Food microbiological examination：Examination of commercial sterility＞，the study showed that the testing results of the indirect impedance method were completely consistent with that of national standard method.Meanwhile，the detection time was shorter than that of conventional method of 7 days.The sample could be determined whether is commercial sterility within 3 days.

Key words：indirect impedance method；acid canned food；commercial sterility

罐藏食品是我国食品工业最重要的出口产品，在国际市场上几乎处于垄断地位[1]。在食品安全问题日益严峻和竞争日益激烈的今天，保证其质量安全卫生尤为重要。罐藏食品依据pH值的不同可分为低酸性罐藏食品和酸性罐藏食品。其中酸性罐藏食品是指杀菌后平衡pH值小于或等于4.6的罐藏食品，其商业无菌的检验是通过将样品保温观察10 d后，再做内容物感官检验、pH值测定和涂片镜检，以确证罐头食品中有无微生物增殖[2]。其检验过程要求较长的保温时间，此外还需要大容量的培养设备，显然该方法已无法满足现代食品质量安全检测的要求，很有必要寻找一种快速的能与传统商业无菌检验等同效果、但更为准确、快速的检测方法。

微生物自动快速检测系统BacTrac4300是基于电阻抗原理设计生产的一种微生物快速检测仪，通过测量微生物代谢引起的电特性变化来测定样品微生物含量[3]。根据测量技术原理，电阻抗法又可分为直接阻抗测量法和间接阻抗测量法。间接阻抗法是通过检测微生物代谢产生的CO2引起的阻抗变化来记录微生物活力水平。在这个过程中，微生物产生的CO2被电极周围的KOH溶液吸收，生成碳酸钾，因而增加溶液的电阻抗。因此测量信号指示的是一个负进程，适合于检测产气芽殖微生物[3-4]。酸性罐藏食品中的腐败菌主要有耐酸芽孢菌、非芽孢耐酸菌、酵母及霉菌[5-13]，均代谢产生终产物CO2，适合采用间接阻抗法。目前间接阻抗法已被应用于检测食品中的金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、植物乳杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、热带假丝酵母和枯草芽孢杆菌等微生物[4，14-18]，而在酸性罐藏食品商业无菌快速检测中的应用却鲜有报道。

拟选取酸性罐藏食品中易污染的多粘芽孢杆菌、肠膜明串珠菌和异常汉逊酵母作为试验菌株，对间接阻抗法在酸性罐藏食品商业无菌的应用进行探索和研究，以期建立一种快速、灵敏、准确、可靠的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多粘芽孢杆菌（CICC 22649）、肠膜明串珠菌（CICC 21861）：中国工业微生物菌种保藏管理中心；异常汉逊酵母（GIM2.94）：广东省微生物菌种保藏中心。

酸性肉汤、麦芽浸膏汤、营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、结晶紫染色液、蛋白胨缓冲液：北京陆桥技术有限责任公司；氯化钠、含4%碘的乙醇溶液、氢氧化钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

微生物自动快速检测系统BacTrac4300：奥地利SY-LAB公司；HVE-50全自动高压灭菌锅：Hirayama Manufacturing Corporation；PL602-S 电子天平、SG2 型pH计：梅特勒－托利多仪器有限公司；HH·B11电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；BCD-226STV冰箱：青岛海尔股份有限公司；AESAP1068拍击式均质器：法国AES公司；VORTEX-GENIE 120涡旋振荡器：美国SCIENTIFIC INDUSTRIES公司；BX51荧光显微镜：日本OLYMPUS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 常规方法

按GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》[2]进行检验。

1.3.2 间接阻抗法

1.3.2.1 试验菌液的制备

取试验菌株多粘芽孢杆菌接种于酸性肉汤培养基，36℃培养24 h；肠膜明串珠菌接种于酸性肉汤培养基，异常汉逊酵母接种于麦芽浸膏汤培养基，36℃培养72 h。将各培养物用无菌生理盐水进行10倍系列稀释，备用。

1.3.2.2 开启酸性罐藏食品并制备样品液

参照GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》[2]中的6.1、6.2、6.4方法开启酸性罐藏食品，液体酸性罐藏食品摇匀后可直接作为样品液使用，固体酸性罐藏食品称取25 g，两者皆有时则各取12.5 g加至225 mL灭菌蛋白胨缓冲液中进行均质混匀得到样品液。

1.3.2.3 临界值的确定

在聚苯乙烯测量瓶中加入1 mL新鲜制备的0.2%KOH溶液，各取1 mL试验菌液分别接种至装有5 mL相应培养基的内瓶中，内瓶完全开放，立即旋紧测量瓶，于15 min内将其放入BacTrac4300培养箱中进行检测。各测量参数预设为培养温度：36℃，测量间隔时间：10 min，测量持续时间：72 h，预热时间：1 h，临界值：-25%M，得到各试验菌液测量曲线。另选取市场多种常见的酸性罐藏食品灭菌后，开启，取1 mL样品液接种至装有5 mL酸性肉汤培养基的内瓶中，另取1 mL样品液接种至装有5 mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中，在相同条件下进行试验，得到阴性样品产生的基线最大漂移值。

1.3.2.4 间接阻抗法的适用性及灵敏度试验

将临界值更改为1.3.2.3确定得到的数值-45%M，其余参数不变，取1 mL系列稀释的各试验菌液分别按1.3.2.3的方法进行阻抗法检测，记录到达临界值的阻抗检测时间（Impedance Detection Time，IDT），同时将试验菌液按GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》[19]进行平板菌落计数。以菌落总数的对数log（CFU）为纵坐标，对应的IDT值为横坐标，将数据输入系统自带的数据处理软件中即可得到标准曲线和回归方程。

1.3.2.5 酸性罐藏食品的检测

各取3 mL被测样品液分别接种至装有3 mL酸性肉汤培养基和3 mL麦芽浸膏汤培养基的内瓶中进行检测，各测量参数设置为：培养温度：36℃，测量间隔时间：10 min，测量持续时间：72 h，预热时间：1 h，评价类型：M2；临界值：-45%M。

1.3.2.6 留样

按GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》中的6.5项进行留样。

1.3.2.7 感官检查和pH值测定

按GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》中的6.6、6.7项对酸性罐头食品内容物进行感官检查和pH值测定。

1.3.2.8 涂片染色镜检

按GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》中的6.8项对留样内容物和内瓶的培养液进行涂片染色镜检。

1.3.2.9 结果的判定

检测结束后，当仪器测量结果为无IDT值时，表明被测酸性罐藏食品中无微生物增殖，经感官检查、pH值测定、涂片染色镜检确证无微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐藏食品为商业无菌；当仪器测量结果IDT＞0时，表明被测酸性罐藏食品中有微生物增殖，经感官检查、pH值测定、涂片染色镜检确证有微生物增殖现象时，可报告该被测酸性罐藏食品为非商业无菌。

2 结果与分析

2.1 间接阻抗法的临界值的确定

仪器在测量过程中将生成两种测量信号值：M值和E值。其中M值是指相对初始值的培养基电阻抗的相对下降百分率（%）。而E值指相对初始值的电极阻抗变化值，受培养基成份的影响不大。根据仪器操作手册，间接阻抗法应选择M值为检测信号值，推荐临界值为-25%M。将试验菌株进行验证试验，得到异常汉逊酵母的测量曲线（图1所示），多粘芽孢杆菌和肠膜明串珠菌的测量曲线与异常汉逊酵母的相似，可见菌株的M值曲线类似微生物的生长曲线，可确定以M值作为检测信号值。

图1 异常汉逊酵母间接阻抗法测量曲线Fig.1 Measuring curve ofHansenula anomalaby indirect impedance method

选取什锦水果罐头、黄桃罐头等13种酸性罐头食品灭菌后作为阴性样品，经检测各阴性样品基线最大漂移值分别为：什锦水果罐头、梨罐头、水黄桃罐头、杨梅罐头、桔子罐头、蜜桔罐头、杏罐头：-25%M；草莓罐头、黄桃罐头：-45%M；山楂罐头、菠萝罐头、柑橘罐头：-20%M；芒果汁罐头：-10%M。图2为黄桃罐头检测曲线，可见阴性样品的基线最大漂移值为-45%M，因此最终确定间接阻抗法的临界值为-45%M。

图2 阴性样品黄桃罐头测量基线Fig.2 Measuring baseline of negative canned yellow peach

2.2 电阻抗法的应用条件研究

2.2.1 电阻抗法的适用性试验

将各试验菌株同时进行电阻抗法和平板计数法检测，分别建立了标准曲线和回归方程，如表1所示。

表1 试验菌株的回归方程及参数Table 1 Regression equations and parameters of experimental strains

结果表明各试验菌株的标准曲线均具有特异性，由此说明电阻抗法对生长特性各不相同的菌株均能灵敏、准确地检测出来，具有广泛的适用性，适用于不同种类的、污染菌来源不明确的酸性罐头食品商业无菌的检测。

2.2.2 电阻抗法的灵敏度试验

将各试验菌株的菌悬液系列稀释，使含菌量＜5 CFU/mL，作平行重复测试，灵敏度试验结果见表2。

表2 灵敏度试验结果Table 2 Experimental results of sensitivity

结果如表2所示，可见试验菌株的5个平行值间无显著差异（P＞0.05），将IDT值分别代入回归方程，所得到的菌落数也相符，表明在菌落数很少的情况下，电阻抗法均能很灵敏地检测出来。

2.2.3 测量持续时间的确定

含菌量1 CFU/mL的试验菌株的检测时间见表3。

表3 含菌量1 CFU/mL的试验菌株的检测时间Table 3 Detection time of the experimental strains containing1 CFU/mL

由表3可见各试验菌株为1 CFU/mL时的最大IDT值均未超过72 h，参考仪器操作手册推荐的测量持续时间48 h～72 h，最终将测量持续时间确定为72 h。

2.2.4 罐头食品取样量的确定

由于罐头食品含菌量低，尽可能地加大取样量可增加试样的含菌量，提高检测的灵敏度，缩短检测时间。标准用于间接法的体积是：5 mL培养基和1 mL样品溶液（样品均质后），如果要扩大样品量，则要加大培养基的浓度，根据仪器操作手册，可将间接阻抗法的样品加样量确定为3 mL样品溶液（样品均质后）和3 mL双料培养基。

2.3 间接阻抗法与常规方法检测酸性罐头食品的比对试验

对同一生产批次的3罐酸性罐头食品，取1罐用间接阻抗法进行检测，另1罐按GB 4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》保温检测，第3罐置2℃～5℃冰箱保存作为对照，结果如表4所示。

表4 间接阻抗法与常规方法检测酸性罐头食品的比对试验结果Table 4 Comparison test results of acid canned food by indirect impedance method and conventional method

间接阻抗法的检验结果均为未检出，按GB4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》进行保温观察，也未见胖听、泄漏、pH值和感官异常，涂片镜检确证也无微生物增殖现象，因此可判定15个样品均为商业无菌。可见，间接阻抗法与常规检测方法的结果完全一致，但比传统方法缩短了7 d时间，且更为简单、便捷。

3 结论

建立应用间接阻抗法快速检测酸性罐头食品商业无菌的方法，与传统方法相比，不需要大容量的保温设备，节省了实验室的空间，且免去了繁琐的操作步骤，3 d内即可完成全部检测过程，比该方法缩短了7 d的时间，提高了检测的效率。所采用的间接阻抗法与直接阻抗法相比，电极不接触酸性罐头样品，不会被样品腐蚀，减少了设备更换的速率；被测样品不干扰阻抗测量，提高了检测的准确度；且可采用传统培养基，无需购买仪器原厂的培养基，大大节约了成本。方法还具有广泛的适用性，适用于不同种类的、污染菌来源不明确的酸性罐头食品商业无菌的检测。本方法与低酸性罐藏食品商业无菌快速检测方法相结合[20]，形成了系统的电阻抗法快速检测罐藏食品商业无菌的方法体系。体系的建立将减少罐藏食品安全卫生检验检疫的时间，加快罐头进出口检验检疫速度，对提升检验检疫机构此项的检验能力，有很高的实用价值，有利于罐头食品行业的发展。

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Study on Detection of Commercial Sterility in Acid Canned Food by Indirect Impedance Method

DU Han-chun1，YE Kai-fu1，LIU Shao-gang2，XU Chan1，SU Mei-qing1，TAN Xue-cai2，*
（1.Guangxi Center for Analysis and Test Research，Nanning 530022，Guangxi，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University for Nationalities，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Pharmaceutical Analytical Chemistry，Nanning 530008，Guangxi，China）

2017-02-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.022

广西自然科学基金项目（2013GXNSFBA019048）；广西科学研究与技术开发计划项目（桂科能14123006-24）；国家自然科学基金项目（21367004、21667005）

杜寒春（1980—），女（汉），高级工程师，硕士，研究方向：食品质量安全与检测。

*通信作者