响应面法优化黄芪发酵工艺研究

刘超，于永军，赵兴华，李希珍，陈俊荣

（沧州医学高等专科学校，河北沧州061001）

响应面法优化黄芪发酵工艺研究

刘超，于永军，赵兴华，李希珍，陈俊荣*

（沧州医学高等专科学校，河北沧州061001）

通过响应面法优化得到酵母菌发酵黄芪的最佳工艺。在单因素试验基础上，以发酵时间、发酵温度、接种量和初始pH值为响应因素，以总黄酮含量为响应值，利用Box-Behnken中心组合方法进行四因素三水平试验设计，进行响应面分析。影响黄芪总黄酮含量的因素主次顺序为发酵温度＞发酵时间＞接种量＞初始pH值，最佳发酵工艺条件为发酵时间9.46 d，发酵温度29.07℃，接种量10.45%，初始pH 6.52，总黄酮预计含量为0.890 mg/mL，在此基础上调整发酵参数进行试验，实际总黄酮含量为0.866 mg/mL，与预计含量相差2.70%。响应面法优化黄芪发酵工艺合理，可用于实践。

响应面法；工艺优化；黄芪发酵；酵母菌

Abstract：To determine the optimal process of Radix Astragali fermented by yeast.On the basis of single factor experiments，a four-factor three-level Box-Behnken central composite design was utilized for mathematical modeling for total flavonoids content as a response to fermentation time，temperature，inoculum concentration and initial pH，followed by responses surface analysis of the relationship between the function and the four variables.The effect order of the four factors on the preparation technology was fermentation temperature＞time＞inoculum concentration＞initial pH.The optimal fermenting conditions were fermentation time 9.46 d，fermen tationtemperature29.07℃，inoculum concentration 10.45%，initial pH 6.52.Undersuchcondition，theestimatted content of total flavonoids contents was 0.890 mg/mL，experiments were conducted after adjusting the fermentation conditions.The actual content was 0.866 mg/mL，lower than estimated content 2.70%.Optimization of fermentation process by response surface methodology was reasonable，this method can be used in practice.

Key words：response surface methodology；optimization process；astragalus fermentation；yeast

黄芪是我国传统的补气中药，迄今已有二千多年的历史，具有免疫调节、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、抗氧化、保肝、防治糖尿病及降低脑缺血损伤等多种药理作用[1]。其中黄酮是一种重要的药效成分，具有增强机体免疫力、抗病毒作用、抗应激功效、促生长、改善心肺功能等多种用途[2-4]。在微生物发酵中药研究中，黄芪是研究比较多的一个中药品种，相关研究文献较多，从黄芪发酵菌种、工艺优化、发酵方式、药效评价、成分变化等方面都有所阐述[5-7]，但总体来说仍处于研究的初级阶段。

酵母菌是单细胞真菌，是被人类广泛应用的微生物，也是发酵黄芪的重要菌种。山西中医学院的郭羽、刘必旺等利用酵母菌发酵黄芪，对发酵后的多糖和黄酮进行测定，发现酵母菌发酵黄芪药材对多糖含量有一定影响，且其产率与传统水煎方法相比有一定程度的提高；他们发现黄芪发酵液可提高糖尿病大鼠的免疫力，对体内、体外受试菌均有一定抑制作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡[8-10]。

本文以黄芪总黄酮的含量为因变量，在单因素试验基础上，采用统计软件Design-Expert中响应面法的Box-Behnken模式，对酵母菌发酵黄芪工艺进行了研究[11-13]，为该药材的资源开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芪：安国药材市场，经鉴定为蒙古黄芪；酵母菌：沧州医学高等专科学校药物研究所保藏；YPD琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限公司；芦丁标准品：中国药品生物制品检定所；碳酸钙、乙醇、蒽酮等所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ZWY-240恒温培养振荡器：上海智诚科技有限公司；超净工作台：海尔股份有限公司；MJ-78A全自动灭菌锅：施都凯仪器设备有限公司；BS 223S分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；HWS恒温恒湿培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；KN-130万能粉碎机：长沙康宁电子科技有限公司；H1650-W高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；756S/759S紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海振捷实验室设备有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

配制YPD琼脂斜面培养基→将保藏的酵母菌接种于斜面培养基→37℃恒温培养2 d～3 d，观察菌种管长菌情况，发现染菌情况马上处理→同样方法活化3次，得到活化菌种。

1.3.2 种子液的制备

将活化菌种接种到YPD液体培养基，恒温振荡培养箱，摇床温度30℃，转速180 r/min，培养24 h，作为种子液备用。

1.3.3 发酵液制备

黄豆芽500 g，加水1 000 mL，煮沸l h，过滤后补足水分，分装100 mL，加入5.0 g黄芪药材粉末，121℃湿热灭菌20 min，为发酵培养基。按一定比例的接种量将种子液接入一定初始pH值的发酵培养基，在一定温度下，摇床转速150 r/min进行恒温振荡培养，在培养一定时间后取出，进行发酵液的前处理：6 000 r/min离心15 min，分离上清和残渣，将对照样品进行平行操作。

1.3.4 发酵工艺单因素试验

发酵时间对于黄芪总黄酮含量的影响：发酵时间为 1、3、5、7、9、11 d，接种量为 10%，发酵温度为 28 ℃，摇床转速为150 r/min，初始pH值为6.5。

发酵温度对于黄芪总黄酮含量的影响：发酵温度为 20、24、28、32、36、40 ℃，发酵时间为 9 d，接种量为10%，摇床转速为150 r/min，初始pH值为6.5。

接种量对于黄芪总黄酮含量的影响：接种量为5%、10%、15%、20%，发酵温度为28℃，发酵时间为9 d，摇床转速为150 r/min，初始pH值为6.5。

初始pH值对于黄芪总黄酮含量的影响：初始pH值为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，发酵时间为 9 d，接种量为10%，发酵温度为28℃，摇床转速为150 r/min。

1.3.5 响应面分析试验

根据单因素试验结果，选择发酵时间、发酵温度、接种量、初始pH值这4个因素为自变量。根据Box-Benhnken设计原理，进行四因素三水平的响应面分析试验，因素水平设计见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface design

以总黄酮的含量为响应值，利用Design Expert 8.0.6.1软件对数据进行分析，得出最佳发酵工艺，试验重复3次[14]。

1.3.6 黄芪总黄酮含量测定

黄芪总黄酮含量测定采用紫外分光光度法[15]，过程如下：首先配制芦丁标准品溶液，经处理后在510 nm波长处有最大吸收峰，测定吸光度，根据浓度与吸光度的关系制作标准曲线，求得回归方程。然后制备样品溶液，样品经处理后在最大吸收峰位置测定吸光度，根据标准曲线计算总黄酮质量浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对黄芪总黄酮含量的影响

发酵时间对黄芪总黄酮含量的影响见图1。

图1 发酵时间对总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of fermentation time on total flavonoids content

由图1可知，发酵时间为1 d～9 d时，发酵液中总黄酮含量随发酵时间的增加而增高，至9 d时达到最高。但当发酵时间再增加时，总黄酮含量却有略微下降。说明发酵时间过长不利于总黄酮的形成，阻碍其生物转化，使总黄酮的含量有所降低。

2.1.2 发酵温度对黄芪总黄酮含量的影响

发酵温度对黄芪总黄酮含量的影响见图2。

图2 发酵温度对总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of temperature on total flavonoids content

由图2可知，温度对总黄酮的含量有一定的影响，发酵温度到达28℃时含量最高，再继续升高温度总黄酮含量略缓慢下降，当温度过高时，总黄酮含量明显下降。此结果与酵母菌的生长规律相吻合，低温和高温都不利于菌体生长，尤其是高温对于菌体生长抑制明显。

2.1.3 接种量对黄芪总黄酮含量的影响

接种量对黄芪总黄酮含量的影响见图3。

图3 接种量对总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of inoculum concentration on total flavonoids content

由图3可知，接种量对总黄酮的含量的影响较小，接种量到达10%时含量最高，再继续增大接种量总黄酮含量有所下降，但是变化幅度并不大。

2.1.4 初始pH值对黄芪总黄酮含量的影响

初始pH值对黄芪总黄酮含量的影响见图4。

图4 初始pH值对总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of pH on total flavonoids content

由图4可知，接种量对总黄酮的含量的影响较大，随着pH值的升高，总黄酮含量逐渐增大，初始pH值到达6.0时含量最高，在6.0～7.0之间变化较小，超过7.0后，总黄酮含量下降明显。

2.2 发酵工艺响应面分析试验

2.2.1 数学模型的建立及显著性检验

试验设计和试验结果见2。

表2 响应面分析试验和结果Table 2 Design and results of response surface analysis

以黄芪发酵液中总黄酮的含量为响应值，采用Design-Expert回归分析软件分析表2中的29个试验点的响应值，经软件综合分析后，各试验因素对总黄酮含量的影响可采用如下回归方程表示出来：

总黄酮含量=0.88+0.041×A+0.062×B+0.028×C+0.018×D+2.750×10-3×A×B-0.039×A×C-0.018×A×D-7.500×10-3×B×C-0.028×B×D-1.000×10-3×C×D-0.081×A2-0.14×B2-0.096×C2-0.077×D2

对模型进行方差分析的结果见表3。

表3 响应面二次模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic mode

可以看出：P模型＜0.0001，表明模型差异极显著；总黄酮含量失拟项P=0.1314，表明失拟不显著，所选用的二次回归模型是适当的；对模型进行回归方程系数显著性检验，得到模型一次项 A、B、C（P＜0.01）差异极显著，一次项D（P＜0.05）差异显著，其影响强弱的排序为：发酵温度＞发酵时间＞接种量＞初始pH值。

2.2.2 总黄酮的响应面分析

利用Design-Expert软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面如图5～图10所示。

图5 发酵时间和发酵温度的交互作用对总黄酮含量影响的响应面Fig.5 Response surface plot showing the effects of time and temperature on total flavonoids contents

图6 发酵时间和接种量的交互作用对总黄酮含量影响的响应面Fig.6 Response surface plot showing the effects of time and inoculum concentration on total flavonoids contents

图7 发酵时间和初始pH的交互作用对总黄酮含量影响的响应面Fig.7 Response surface plot showing the effects of time and pH on total flavonoids contents

图5～图10为当固定发酵时间、发酵温度、接种量和初始pH值中任意两个因素为零水平时，其余两个因素的交互作用及对总黄酮含量的影响。总黄酮含量随着任意两个变量的增加均呈上升趋势，当达到某一定值时，曲面下降或区域平缓，通过响应面图能够观察出最高点。

2.3 验证试验

通过对回归模型求解方程，得出黄芪发酵总黄酮最佳发酵工艺为发酵时间9.46 d，发酵温度29.07℃，接种量10.45%，初始pH 6.52，在此条件下总黄酮预计含量为0.890 mg/mL。为了便于试验，把发酵参数进行调整如下：发酵时间9.5 d，发酵温度29℃，接种量10.5%，初始pH 6.5，进行3组平行试验，所得总黄酮的含量的分别为0.866、0.875、0.858 mg/mL，其平均值0.866 mg/mL，与回归方程所得的总黄酮预计含量0.890 mg/mL的相对误差为2.70%，该回归方程可用于实践。

图8 发酵温度和接种量的交互作用对总黄酮含量影响的响应面Fig.8 Response surface plot showing the effects of temperature and inoculum concentration on total flavonoids contents

图9 发酵温度和初始pH值的交互作用对总黄酮含量影响的响应面Fig.9 Response surface plot showing the effects of temperature and pH on total flavonoids contents

图10 接种量和初始pH值的交互作用对总黄酮含量影响的响应面Fig.10 Response surface plot showing the effects of inoculum concentration and pH on total flavonoids contents

3 结论

黄芪是我国传统的中药材，其使用有几千年的历史，中药发酵技术改善了黄芪的药效作用，为更好的利用黄芪开创了一条新的道路。总黄酮是黄芪中重要的药效成分之一，对其发酵工艺的研究还比较欠缺，通过本试验的数据分析，可以找到一种最有效的发酵工艺，为黄芪的开发和利用奠定了试验基础。

以总黄酮含量为响应值，利用响应面分析法优化酵母菌发酵黄芪的最佳工艺条件为：发酵时间9.46 d，发酵温度29.07℃，接种量10.45，初始pH 6.52，在此条件下黄酮预计含量为0.890 mg/mL。将发酵参数在此基础上进行调整，进行3组平行试验，所得总黄酮的平均含量为0.866 mg/mL，与回归方程所得的总黄酮预计含量相差2.70%，该模型可较好的应用于发酵工艺的优化。

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Optimization of Fermentation Process of Radix Astragali by Response Surface Methodology

LIU Chao，YU Yong-jun，ZHAO Xing-hua，LI Xi-zhen，CHEN Jun-rong*
（Cangzhou Medical College，Cangzhou 061001，Heibei，China）

2017-03-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.014

河北省科学技术研究与发展计划自筹经费项目（16272509）

刘超（1979—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：发酵工艺优化。

*通信作者：陈俊荣（1963—），女，教授，研究方向：黄芪发酵。